摘要
食源性疾病的高发病率使得微生物污染问题备受关注。然而大多数化学防腐剂及其副产品的对人体的安全性不能完全保证，并且缺乏环境兼容性。研发安全、高效的天然抗菌剂是一直以来的热点，天然活性成分例如植物源的黄酮类化合物引起了研究者的关注。银杏叶黄酮具有广谱的抑菌活性，展现了优秀的作为天然防腐抑菌剂的潜力。但植物提取物中黄酮类化合物通常杂质较多、纯度低，无法对其进行有效的研究和应用。本文以银杏叶黄酮提取物为原料，通过大孔树脂、聚酰胺柱层析法对其分离纯化，对纯化物的抗氧化、抑菌活性以及抑菌机理进行探究。得到的主要的研究结果如下： （1）筛选了纯化银杏叶黄酮提取物的树脂 通过吸附解吸实验，确定NKA-9大孔树脂适用于纯化银杏叶黄酮。平衡最大吸附率为65.47%，吸附平衡时间为4.5h；最大解吸率达99.01%，解吸时间1h。吸附过程为自发的放热反应，更适合在低温条件下进行。 （2）利用NKA-9大孔树脂和聚酰胺树脂分离得到了纯化黄酮 NKA-9纯化条件为：提取物黄酮浓度0.8mg/mL，pH为5，上样流速0.6BV/h，用70%的乙醇溶液以1.0BV/h流速洗脱，洗脱剂用量4BV。纯化后的黄酮纯度为56.42%，是黄酮提取物的两倍多。HPLC分析显示纯化黄酮中黄酮醇苷元（槲皮素、山奈酚、异鼠李素）的含量分别由33.25%、2.56%和1.06%提高为51.77%、5.82%和1.54%。聚酰胺树脂分离得到了总黄酮醇苷元，三种苷元含量分别为27.21%、45.34%和21.33%。 （3）纯化黄酮的抗氧化和抑菌活性显著提高 纯化总黄酮和黄酮醇苷元的自由基的清除效果和抑菌活性明显增强。在浓度为0.10mg/mL时，NKA-9纯化黄酮对DPPH·和ABTS?+自由基清除率分别为87.5%和92.5%；聚酰胺分离的黄酮醇苷元的自由基清除率分别为92.9%和97.2%。NKA-9纯化黄酮对三种致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌）的最小抑菌浓度分别为0.45、0.9、0.9mg/mL；黄酮醇苷元的最小抑菌浓度分别为0.225、0.45、0.45mg/mL。 （4）探究了纯化黄酮的抑菌机理 纯化黄酮具有显著抑菌活性，并且抑制效果随着黄酮浓度的增大而明显增强。这种抑菌作用机制主要通过破坏细胞壁和细胞膜结构，使细胞丧失活力。提高细胞内ROS水平，使细胞发生氧化损伤。增大细胞膜通透性，使细胞内容物泄漏，致使细菌死亡。
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