摘要
MiT/TFE家族蛋白是一类在进化中高度保守的转录因子，包括TFEB、TFE3、MITF和TFEC。它们在哺乳动物细胞中广泛表达，参与了细胞分化、个体发育和免疫反应等多种重要的生理过程。TFEB和TFE3是调控自噬发生和溶酶体形成相关基因表达的主要转录因子，对于维持细胞自噬和溶酶体功能至关重要。多种人类疾病（如癌症和神经退行性疾病等）与自噬和溶酶体功能紊乱有关。因此，TFEB和TFE3的分子调控机制的研究对于理解自噬和溶酶体的功能调控，以及开发相关疾病干预方法具有重要意义。 在本文第二部分中，我们发现了一条新的调控TFEB和TFE3的信号通路，该通路涉及了赖氨酰tRNA合成酶(LysRS)与蛋白翻译无关的非经典功能。首先，细胞饥饿后，LysRS会响应饥饿压力从多氨酰tRNA合成酶复合物(MSC)上解离并进入细胞核;通过免疫荧光和免疫共沉淀实验，我们发现饥饿会促进LysRS与TFEB及TFE3的结合。这种增强的相互作用提示我们LysRS可能参与了对TFEB、TFE3的调控。荧光素酶报告基因及逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验表明，LysRS能促进TFEB和TFE3下游基因的表达。LysRS对TFEB和TFE3的调控提示其可能参与了自噬过程。利用小干扰RNA(siRNA)敲低LysRS后，细胞自噬受到了明显的抑制。这些实验结果证明LysRS能调控TFEB和TFE3的转录活性从而影响细胞自噬。LysRS-TFEB/TFE3信号通路的发现既拓展了对TFEB和TFE3调控机制的认识，也加深了对LysRS非经典功能的理解。 TFE3的高表达和持续激活促进包括胰腺癌在内的多种癌细胞生存;并且TFE3基因融合会导致肾细胞癌、腺泡状软组织肉瘤(ASPS)、上皮样血管内皮瘤(EHE)、血管周上皮样细胞肿瘤(PEComas)等癌症发生。但一直以来，TEF3被认为是不可成药的靶点。本文第三部分中，我们通过多序列比对和晶体结构分析，发现TFE3存在相对动态的结构，变温圆二色谱实验佐证了这一发现。这种动态性给予了TFE3被小分子化合物直接抑制的可能。根据TFE3通过与下游基因结合促进转录来发挥其生物学功能，我们设计了破坏TFE3和启动子结合的筛选模型，并建立了基于荧光偏振的高通量TFE3抑制剂筛选平台。筛选实验结果表明，该筛选平台具有信噪比高、重复性好和Z''因子高等特点，适合于TFE3抑制剂的高通量筛选工作。 通过对约3000个FDA批准的成药化合物的筛选，我们发现了29个潜在的TFE3抑制剂并对其中的一部分化合物进行了进一步研究。结合凝胶电泳迁移实验，我们去除了荧光偏振实验中的一些假阳性化合物，并发现了在体外实验中活性最高的化合物E3i-2。我们对E3i-2进行了较深入的研究。RT-qPCR实验中，E3i-2展示了对TFE3下游基因的抑制作用。然而染色质免疫共沉淀实验(ChIP)显示，E3i-2在细胞内不能广泛地破坏TFE3与靶基因的结合。这可能是由于E3i-2在细胞内被其它生物分子结合，使其不能充分地对TFE3发挥作用。最后，转录组测序(RNA-seq)数据表明，E3i-2确实缺乏对TFE3的选择性。因此，在后续研究中，还需要通过药物化学改良E3i-2的选择性。同时，对E3i-2的研究过程给予了我们宝贵的经验，为接下来开展对其他候选化合物的鉴定工作打下了坚实的基础。
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