摘要
苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，BaP)是化学性质稳定、生物毒性高且难以降解的多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)类污染物，可在环境中持久存在，具有致癌、致畸、致突变的特性，对环境和人体健康造成巨大的威胁。微生物降解被认为是去除BaP污染的有效手段，但由于BaP的高疏水性和高细胞毒性，目前发现只有极少数的微生物能以BaP为唯一碳源和能源进行降解代谢，并且这些微生物对BaP的降解转化效率也都十分有限。研究发现微生物群落可以通过菌间协同作用提高BaP的降解效率，因此不少研究通过构建人工合成菌群寻求突破BaP降解瓶颈的可能性。然而，由于微生物群落的菌间关系及代谢网络错综复杂，合成菌群的组装依据不足，目前还未获得能够高效降解BaP的合成菌群。实验室前期工作对一株以BaP为唯一碳源和能源生长的NovosphingobiumpentaromativoransUS6-1展开研究时发现，该菌具有完整的BaP降解通路，但在降解BaP过程中细胞生长缓慢，降解启动后不久便进入降解停滞状态，表现出细胞代谢活性低、污染物转化效率低等问题，而这很可能是由于BaP极高的生物毒性所致。因此，通过解除污染物生物毒性引起的代谢限制可能是提高BaP降解效率的有效途径。基于此，本研究以BaP作为目标污染物，以US6-1作为关键降解菌株，以解除BaP对降解菌细胞的代谢限制为组装依据，采用微生物培养组、分子标记、基因组和代谢组分析等技术手段，开展高效降解BaP菌群的设计、构建与优化的研究，为难降解有毒污染物的微生物控制提供理论和技术支撑。主要研究结果如下: 1.为了获得组装合成菌群的骨架结构和菌种资源，构建了以红树林沉积物为基质、BaP为驯化压力的富集体系，通过16SrRNA基因高通量测序追踪群落结构演替，并持续分离筛选可培养菌株。结果发现，富集体系微生物群落的α多样性在BaP压力下逐渐下降，群落结构显著变化，在富集驯化的前期，群落中的优势菌属和显著富集的菌属分别为Limnobacter和Denitromonas还有Ignavibacterium;而在富集驯化中期，Marinobacter成为优势菌属，Rhodanobacter、Acinetobacter被显著富集，这三属中分布有众多的PAHs降解菌;在富集驯化的后期，群落中具有较强的抗胁迫能力和环境适应性的菌属Tistlia被显著富集。与此同时，我们从不同驯化阶段的富集物中分离获得了92株细菌，基因组分析发现，其中Novosphingobiumaromaticivorans、Pseudomonaskunmingensis和Bacilluscereus等15株菌具有PAHs降解潜能。而Labrenziaaggregata、Gordoniabronchialis和Citricoccuszhacaiensis等菌株则具有产表面活性剂、代谢BaP下游代谢产物以及抗氧化压力等潜能，是潜在的辅助降解菌。以上结果为构建合成菌群提供了设计思路与菌种资源。 2.为了实现BaP高效降解菌群的高通量筛选，构建了携带pPK415-eGFP质粒的荧光报告菌株US6-1∷eGFP，以高效快速地追踪关键降解菌US6-1在菌群共培养体系中的生长状况。将US6-1∷eGFP与菌种库中的辅助降解菌通过共培养方式构建了二元、三元和四元的合成菌群共234个，以US6-1∷eGFP生物量的提高作为标准进行初筛，发现三元组合US6-1+M9-3-2+Bacillusaryabhattai和两个四元组合US6-1+M9-3-2+Bacillusaryabhattai+Citricoccuszhacaiensis和US6-1+M9-3-2+Bacillusaryabhattai+Bacillusenclensis中US6-1∷eGFP的生物量显著提高且培养体系pH保持在中性-弱酸性范围;接着以合成菌群对BaP的降解率为标准进行复筛，发现四元组合US6-1+M9-3-2+Bacillusaryabhattai+Citricoccuszhacaiensis以10ppmBaP为唯一碳源培养6天后对BaP的降解率为58.22％，相较于US6-1单菌的降解率(37.84％)显著提高。 3.为了解析和优化合成菌群，对合成菌群进行了基因组和代谢组分析。基因组分析发现，降解菌US6-1在磷酸戊糖途径和蛋氨酸合成途径的代谢缺陷影响抗氧化分子谷胱甘肽的合成，可能是导致ROS激增的原因之一。在BaP压力下辅助降解菌株NitrogeniibactermangroviM9-3-2、Bacillusaryabhattai和Citricoccuszhacaiensis可能通过代谢交换的方式为降解菌提供蛋氨酸等谷胱甘肽前体，或者利用抗氧化酶黄素氧还蛋白、谷胱甘肽二硫化物还原酶和硫醇过氧化物酶帮助降解菌抵御氧化压力;而通过US6-1与合成菌群降解BaP的代谢组比较分析发现，丁酸、乙醇酸和乳酸等小分子酸以及邻苯二甲酸二丁酯、1-苯基-萘、1-羟基芘和对苯二甲酸等有毒中间产物在US6-1代谢产物中显著积累，而在合成菌群的代谢产物中均未检出。结合比较基因组发现，辅助降解菌的基因组中具有丁酸、乙醇酸和乳酸的代谢基因。以上结果表明，辅助菌可能通过清除ROS、消耗US6-1产生的小分子酸和毒性中间产物的方式，提高培养体系的pH、降低ROS水平并促进US6-1的生长与降解。 本研究以解除降解菌代谢限制为思路，通过辅助菌株的高通量筛选与组合，结合高效的检测手段，最终获得降解菌生长与降解效率显著提升的BaP降解合成菌群，并推测了降解菌与辅助菌株之间可能存在的代谢互作模式，有望为BaP及其他复杂有毒污染物的降解与生物修复提供菌株资源与理论支撑。
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