摘要
大黄鱼(Larimichthyscrocea）是我国重要的海洋经济鱼类，连续多年位列我国海水鱼类养殖产量之首。然而，大黄鱼养殖过程中产业粗放式快速发展，制约产业健康发展的瓶颈问题不断涌现，其中就包括养殖严重依赖鲜杂鱼的问题。鲜杂鱼的大量使用不仅浪费渔业资源、污染养殖环境，其携带的潜在病原微生物还对养殖对象的健康产生负面影响，严重制约了大黄鱼养殖产业的健康发展。发展配合饲料作为鲜杂鱼饵料的替代产品成为产业发展的必然趋势。但大黄鱼配合饲料主要以鱼粉等动物性蛋白质为主要蛋白源，价格高昂，难以获得经济效益。植物蛋白替代配合饲料中的鱼粉，在大黄鱼养殖产业中逐步受到重视，但因其含有较多植物蛋白而影响大黄鱼的消化利用，其普及率仍然较低。改善配合饲料的利用率是大黄鱼养殖产业面临的突出问题。除通过改良饲料配方、改进饲料加工工艺等方法逐步研发出大黄鱼全价配合饲料外，有必要对大黄鱼进行植物蛋白利用率性状解析和遗传改良，提高养殖群体对配合饲料的适应性和利用率。鉴于此，本文旨在通过对大黄鱼利用植物蛋白性状进行遗传解析、应用全基因组选择育种技术培育能够利用植物蛋白的大黄鱼新品系，主要结果如下: 1.大黄鱼利用植物蛋白的转录调控机制解析 制备植物蛋白源分别替代30％、50％、70％鱼粉的配合饲料，分别投喂平均体重为150.8g的3组大黄鱼120d。结果显示70％替代组的鱼生长速度与对照组(30％替代组）没有显著差异(P＞0.05)。分析3组大黄鱼后肠和肝脏转录组，经两两对比，分别在后肠和肝脏中获得521个和1048个非冗余差异表达基因。对差异表达基因进行富集分析发现3个实验组共同富集到的GOterm只有1个:碳水化合物结合(GO:0030246)。KEGG通路分析结果显示3组中后肠均显著(P＜0.05)富集到精氨酸生物合成(ko00220)和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)通路。蛋白互作网络分析检测到到连接水平最高的7个枢纽基因(h2afz、ezh2、hdac7、old、hcfc1、trrap、lmna），对这些枢纽基因的功能进行进一步研究，发现其参与了氨基酸、蛋白质的重要生理生化过程。 2.大黄鱼利用植物蛋白的肠道菌群调控机制解析 分别从上述30％、50％和70％替代组中随机抽取3尾实验大黄鱼，再从投喂鲜杂鱼的网箱中随机抽取3尾大黄鱼，采集肠道内容物样本进行肠道菌群分析。经meta分析，从4组中得到1602个扩增子序列变异体(ASVs)。4组鱼肠道菌群在门水平的群落组成相似，包括变形菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、异常球菌-栖热菌门、梭杆菌门和芽单胞菌门。使用edgeR进行差异丰度分析结果表明，3个配合饲料组中，劳森氏菌属(Lawsonia）的丰度明显更高，有益菌乳杆菌属(Lactobacillus）的丰度在30％和50％替代组中下降、在70％替代组中显著提高。通路分析共显著富集到16条KEGG通路，其中5个与免疫系统有关。对4组大黄鱼肠道样本的组织学观察结果显示，50％和70％替代组的杯状细胞显著增加。 3.植物蛋白源替代鱼粉对大黄鱼生长性状的影响 按照等氮等能原则制备了C、P两种实验饲料，鱼粉含量分别为28.00％、10.00％，植物蛋白原料含量分别为47.81％、63.11％。挑选大小均匀的大黄鱼2048尾，注射PIT电子标记后，将其随机分为两组，随后在2个养殖网箱中分别用C、P饲料养殖206d，在实验过程中的三个时间点(0/1d、84/85d和206/207d)分对两组实验鱼别进行体重(BW)测量。实验结果显示，C组和P组的最终成活率分别是47.10％和46.69％，C组与P组间各阶段成活率差异均不显著(P＞0.05)。实验第84d(8～11月，高温期），增重率(WGR1)和特定生长率(SGR1)在C组和P组间没有显著差异(P＞0.05)。实验第85～206d(11月～次年3月，低温期），C组的增重率(WGR2)、特定生长率(SGR2)显著高于P组(P＜0.05)。增重率、特定生长率与初始体重间的相关系数均极低(|r|＜0.15)。特定生长率(SGR)与增重率(WGR)间的相关系数均大于0.998，显示出两个性状间的高度相关性。 4.大黄鱼利用植物蛋白性状全基因组关联分析 对上述C、P两组饲料利用效率性状(增重率和特定生长率）进行了全基因组关联分析(GWAS)，共有891个个体和34994个SNP通过了GWAS分析的质量控制程序。共得到41个与大黄鱼对植物蛋白利用效率潜在关联的SNP，它们分布在16条染色体上。共发现36个与WGR相关的SNP，并在18号染色体的11.9-18.9Mb处发现一个显著的峰值。大黄鱼对植物蛋白利用效率性状属于微效多基因控制的复杂性状，该研究为大黄鱼利用植物蛋白的基因组选择提供了理论参考数据。 5.大黄鱼利用植物蛋白性状全基因组选择育种研究 大黄鱼在高植物蛋白饲料喂养下，增重率性状的遗传力为0.166，虽然遗传力偏低，但应用全基因组选择仍具有进行遗传选育的潜力。基于GWAS信息的SNP子集选取的预测准确性高于随机选择，对于WGR性状，当SNP数量为50或250时，基于GWAS信息SNP选取方式的估计育种值的精度与使用所有SNP的预测精度基本相当，对于BL性状，2500个标记足以获得与使用所有标记相当的预测精度。最后，我们遴选GEBV排名前6％左右的亲本个体进行人工繁育，成功培育了大黄鱼利用植物蛋白品系。 本文开展大黄鱼利用植物蛋白的转录调控机制解析、肠道菌群调控机制解析、全基因组关联分析，为高植物蛋白含量的大黄鱼配合饲料研发提供了重要的理论支撑;开展大黄鱼利用植物蛋白基因组选择育种，有望从遗传学与遗传育种的角度，为基于植物蛋白研发的大黄鱼配合饲料的推广普及提供良种解决方案，有助于降低养殖大黄鱼饲料成本、配合饲料全面替代鲜杂鱼、保护生态渔业资源，实现大黄鱼养殖产业绿色可持续高质量发展。
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