摘要
研究背景 胃癌在国内是最常见的恶性肿瘤之一，患病率和死亡率都位居全国第三。分子靶向治疗已成为胃癌治疗的研究热点，其中HER2是第一个被证实有效的分子靶标。曲妥珠单抗是靶向HER2的单克隆抗体，通过抑制HER2相关通路来发挥抗肿瘤作用。在临床中，曲妥珠单抗显著延长了HER2阳性转移性胃癌患者的总生存期，但大部分患者在治疗有效后1年内出现耐药。XB130是新发现的接头蛋白，能够激活肿瘤相关的多条信号通路，同时又被多种酪氨酸激酶如HER2、EGFR及SRC等磷酸化激活，因而广泛参与肿瘤生长过程，被认为是潜在的诊疗靶点。该课题主要研究XB130在胃癌曲妥珠单抗耐药中的作用及其分子机制。 内容和方法 1.以剂量递增法建立人曲妥珠单抗耐药胃癌细胞株，CCK8检测其对曲妥珠单抗的敏感性。 2.Westernblot检测亲代/耐药细胞XB130、AKT、p-AKT、SRC、p-SRC(Tyr416、Tyr527)及PTEN的蛋白水平，QRT-PCR检测XB130和PTEN的表达水平。 3.Co-IP检测亲代/耐药细胞XB130与PI3Kp58α的结合作用;以SRC抑制剂处理耐药细胞，检测结合水平的变化。 4.以XB130shRNA、XB130shRNA联合Myr-Akt分别转染耐药细胞，检测曲妥珠单抗敏感性和p-AKT表达的变化。 5.以生物信息学方法预测XB130与PTEN的结合位点，荧光素酶报告基因实验检测XB130对PTEN基因的调控作用。 6.以PTENwt/mut、XB130shRNA联合PTENshRNA分别转染耐药细胞，检测曲妥珠单抗敏感性和p-AKT、p-SRC表达的变化。 7.以亲代/耐药细胞、耐药细胞XB130shRNA/NC分别建立荷瘤小鼠模型，经曲妥珠单抗处理后绘制肿瘤生长曲线，IHC检测肿瘤组织XB130、PTEN、SRC/p-SRC的表达。 8.收集经曲妥珠单抗治疗后进展的转移性胃癌患者的临床病理资料，IHC检测进展前后肿瘤组织XB130、PTEN、SRC/p-SRC表达的变化。 9.使用SPSS17.0和GraphPadPrism通过ANOVA或Student''st检验（双侧）比较差异。数据以均值±标准差表示，P＜0.05即差异有统计学意义。 结果 1.曲妥珠单抗耐药胃癌细胞对曲妥珠单抗敏感性显著降低。 2.耐药细胞的XB130、p-AKT、p-SRC(Tyr416)表达上调，PTEN表达下调。 3.耐药细胞的XB130与PI3Kp85α结合力增强，经SRC抑制剂作用后，二者结合力减弱。 4.沉默XB130，耐药细胞的p-AKT表达下调，对曲妥珠单抗的敏感性增强;共转染XB130shRNA和Myr-Akt，细胞对曲妥珠单抗的敏感性恢复。 5.XB130与PTEN启动子存在结合位点，且负性调节PTEN基因转录。 6.同时沉默XB130和PTEN，耐药细胞的p-AKT和p-SRC表达未下调，对曲妥珠单抗的耐药性恢复。 7.XB130敲低组小鼠经曲妥珠单抗处理后，移植瘤生长减慢，其肿瘤组织的XB130和p-SRC表达降低，PTEN表达升高。 8.临床上对曲妥珠单抗耐药的胃癌患者，其肿瘤组织的XB130、p-SRC表达升高，PTEN表达降低。 结论 1.XB130参与调控HER2阳性胃癌对曲妥珠单抗的耐药。 2.XB130在SRC激酶介导下通过结合PI3Kp85α磷酸化激活AKT调控曲妥珠单抗耐药的发生。 3.XB130通过调节PTEN基因转录在SRC-XB130-PTEN之间形成正反馈环并介导曲妥珠单抗耐药的发生。 4.体内动物实验和临床病例资料证实XB130参与调控HER阳性胃癌对曲妥珠单抗的耐药。
NETL