摘要
研究背景: 甲型流感病毒(InfluenzaAvirus，IAV)是常见的流感病毒，可导致严重的急性呼吸道疾病，其主要攻击肺泡上皮细胞和呼吸道上皮细胞，可造成肺泡上皮损伤并阻碍气体交换，进而导致肺炎，发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，易造成季节性流感或诱发全球性大流行。由于甲型流感病毒传播范围广、抗原突变速度快，疫苗的更新速度有限，抗流感药物应对流感病毒感染仍是防治流感的重要举措之一。以抑制病毒神经氨酸酶为主的抗流感病毒药物已在临床上广泛使用，然而其相应的耐药株出现，为流感的防治带来困难。因此，新的抗病毒药物在作用机制上亟待突破，其中围绕病毒复制的聚合酶和宿主免疫的抗病毒药物研发已成为当前创新药物研发领域的发展方向。针对流感病毒聚合酶，新型速效抗流感药物巴洛沙韦(Xofluza)的成功上市，拓宽了人类开发抗病毒药物的传统理念。而调节宿主免疫的抗病毒药物研究，成为抗病毒药物研发的新方向。若将两种策略相结合，将有可能构成抗病毒药物研发的新契机。 近年来，天然产物的研发备受关注，其具有毒性低，多靶点的重要特征。千金藤素（Cepharanthine，CEP），是从防己科植物头花千金藤、地不容中分离提取的双苄基异喹啉生物碱，具有抗肿瘤、抗疟疾、抑菌、调节免疫功能等作用。千金藤素片在临床上主要作为白细胞增生药，能促进骨髓组织增生，从而使外周血白细胞增多。近来的研究表明千金藤素对于多种冠状病毒（包括SARS-CoV2和OC43)都具有抑制作用，曾经用于SARS的临床治疗，目前正开展千金藤素治疗新冠的临床研究。这些结果均表明千金藤素很可能具有广谱抗病毒作用。但千金藤素在抗流感病毒方面的应用尚未见报道。 研究目的: 我们拟评价千金藤素体内外抗流感病毒药效，从病毒和宿主两方面组合揭示千金藤素抗甲型流感病毒的作用机制，从而探究千金藤素抗甲型流感病毒的作用靶点，阐明千金藤素抗炎的作用机制。本研究为挖掘老药的新用途提供参考，为千金藤素作为一种抗甲型流感病毒的潜在药物开发提供科学依据，为临床治疗提供潜在新方案。 实验方法: 1.采用MTT法测定千金藤素对靶细胞的毒性，利用细胞病变法、空斑减少法检测千金藤素对不同亚型甲型流感病毒的抑制活性; 2.采用间接免疫荧光法、Westernblotting以及qRT-PCR等方法检测千金藤素对甲型流感病毒复制的影响; 3.采用MTT法检测千金藤素和神经氨酸酶抑制剂zanamivir联用的效果; 4.采用mini-replicon实验检测流感病毒聚合酶的活性; 5.采用Westernblotting和qRT-PCR探究千金藤素对流感病毒感染诱导的炎症反应的影响和机制; 6.采用STAT1和STAT2敲低实验检测千金藤素对JAK/STAT通路的影响; 7.采用Westernblotting和免疫共聚焦实验检测千金藤素对NF-κB通路的影响; 8.建立流感病毒感染小鼠模型，评价千金藤素在体内的抗甲型流感病毒作用。 实验结果: 1.千金藤素能够抑制多种亚型的甲型流感病毒活性，包括A/WSN/1933(H1N1)，A/Aichi/2/68(H3N2),A/PuertoRico/8/34(H1N1),A/FM-1/1/47(H1N1)。IC50分别为2.34±0.86、5.50±2.22、1.08±0.72及3.51±0.47μM; 2.千金藤素在甲型流感病毒的早期复制阶段发挥重要作用; 3.千金藤素能显著地降低流感病毒聚合酶的活性，且具有剂量依赖性; 4.千金藤素与神经氨酸酶抑制剂zanamivir联用指数＜0.1，具有协同抗流感病毒作用; 5.千金藤素能够抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路激活相关蛋白如p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2和p-NF-κBp65的表达，显著减少相关细胞因子过度表达; 6.千金藤素可减轻流感病毒感染引起的肺损伤，降低肺部病载量并提高流感感染小鼠的生存率。 结论: 1.千金藤素在体外能够抑制不同亚型甲型流感病毒的活性且细胞毒性较低; 2.千金藤素能抑制甲型流感病毒的早期复制; 3.千金藤素可通过抑制甲型流感病毒聚合酶的活性发挥直接抗病毒作用; 4.千金藤素与zanamivir联用具有协同抗流感病毒作用; 5.千金藤素发挥抗炎作用可能与其抑制JAK/STAT和NF-κB信号通路有关; 6.千金藤素具有一定的体内抗甲型流感病毒作用。
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