摘要
卵巢癌是病死率最高的女性生殖系统恶性肿瘤。卵巢癌大多发病隐匿，进展迅速，加之缺乏有效且灵敏的早期诊断措施，60％以上的病人初次诊断时已属晚期。由于缺乏持久、有效的治疗手段，5年生存率徘徊在45％左右。近年，抗血管生成药物以及PARP抑制剂的应用，使部分病人受益，但仍不能从根本上改变卵巢癌的治疗结局。因此，促进卵巢癌发生及发展的分子机制以及诊断、预后的分子标记物有待进一步阐明。 生物体内蛋白质的数量远远多于编码基因的数量，造成这种差异的机制在于基因的选择性剪接。研究表明，大于95％的人类编码基因发生了选择性剪接，剪接的异常与多种疾病相关，其中恶性肿瘤中可变剪接水平明显增加。RNA结合蛋白在可变剪接中发挥着重要作用。研究证实，RNA结合蛋白参与肿瘤的增殖、侵袭和转移、凋亡、血管生成、耐药等发生发展的多个方面，是调控恶性肿瘤进展的关键因素。 SF3B是核心剪接因子U2小核糖核蛋白的七聚体蛋白复合物，对前体mRNA的剪接和3''端的加工至关重要。现有研究表明，SF3B1、SF3B2、SF3B3等SF3B的亚基通过调控下游基因的可变剪接影响人类恶性肿瘤的发生和发展。其中，SF3B1的小分子抑制剂也在不同肿瘤中表现出了很好的抑癌疗效。通过TCGA数据库筛选我们发现，卵巢癌中SF3B4表达显著上调，其高表达与患者的不良预后相关。研究表明，SF3B4不仅仅参与pre-mRNA的剪接，也参与DNA的转录、mRNA的翻译以及信号通路转导等多个生物学过程。在肝癌中，SF3B4通过调控KLF4促进肝癌细胞的恶性行为。食管癌中，SF3B4同样起促癌基因的作用。相反，在胰腺癌中，SF3B4则发挥着抑癌的作用。然而，SF3B4在卵巢癌发生发展过程中的生物学功能及剪接机制尚未见报道。 本课题探究了SF3B4在卵巢癌中的表达情况、发挥的生物学功能及临床意义。并进一步探讨了其上、下游调控机制。具体研究内容分以下三部分进行阐述: 第一部分:SF3B4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究。 第二部分:卵巢癌中SF3B4下游剪接事件的筛选与功能研究。 第三部分:卵巢癌中SF3B4上游调控机制研究。 第一部分SF3B4在浆液性卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能研究 研究目的 检测SF3B4在浆液性卵巢癌中的表达情况，探索其表达水平与卵巢癌患者临床病理特征及预后的关系。探讨SF3B4对卵巢癌细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响，及其对动物体内成瘤能力的影响。 研究方法 应用TCGA数据库及RBPDB数据库分析浆液性卵巢癌中异常高表达的RNA结合蛋白，应用CSIOVDB数据库分析与卵巢癌患者预后显著相关的RNA结合蛋白。应用TCGA数据库分析SF3B4在泛癌中的表达情况。 应用TCGA-GTEX数据库分析高级别浆液性卵巢癌、正常卵巢上皮及输卵管上皮中SF3B4mRNA的表达情况。应用CPTAC-JHU数据库分析高级别浆液性卵巢癌组织与正常卵巢上皮组织中SF3B4蛋白表达情况。应用TCGA数据库分析SF3B4DNA在卵巢癌中的拷贝数变异及其mRNA表达与拷贝数变异的相关性。应用Kaplan-MeierPlotter及CSIOVDB数据库分析SF3B4表达水平与卵巢癌患者预后的相关性。 qRT-PCR及Western-Blot检测SF3B4mRNA及蛋白表达水平在浆液性卵巢癌与输卵管上皮组织中的差异。应用免疫组化检测临床样本中SF3B4的表达情况，分析SF3B4表达与卵巢癌患者临床特征的关系。 构建SF3B4稳定过表达卵巢癌细胞系及SF3B4敲减卵巢癌细胞系，体外通过MTT及EdU细胞增殖实验、平板克隆形成实验验证SF3B4对卵巢癌细胞体外增殖的影响，通过Transwell实验证实SF3B4对卵巢癌细胞体外迁移、侵袭的影响。通过裸鼠皮下成瘤实验证明SF3B4对卵巢癌细胞异体成瘤能力的影响。研究结果 1.SF3B4在卵巢癌中高表达且与不良预后相关 TCGA、CSIOVDB数据库分析显示SF3B4、IGF2BP2、IGF2BP3是卵巢癌中异常高表达且与不良预后显著相关的3个RNA结合蛋白。其中，仅SF3B4为核心剪接因子。TCGA-GTEX数据库分析显示高级别浆液性卵巢癌中SF3B4mRNA的表达较正常卵巢和输卵管组织明显升高。CPTAC-JHU数据库分析显示高级别浆液性卵巢癌中SF3B4蛋白的表达较正常输卵管上皮组织明显升高。生存预后分析结果显示:SF3B4高表达与卵巢癌患者不良的临床预后相关(P＜0.05)。 2.SF3B4在卵巢癌临床样本及细胞系中高表达 qRT-PCR检测新鲜组织中SF3B4mRNA的表达，WesternBlot检测新鲜组织样本中SF3B4蛋白的表达，结果显示SF3B4mRNA及蛋白在浆液性卵巢癌中的表达较正常输卵管组织明显升高。卵巢癌细胞系HEY、A2780及SKOV3中SF3B4蛋白表达水平较输卵管上皮细胞系FT187明显升高。 3.SF3B4水平与卵巢癌患者CA125、网膜转移、铂耐药等相关 我们对117例浆液性卵巢癌样本组织进行免疫组织化学染色，结果提示:SF3B4的表达水平与患者年龄(p=0.018)、血清CA125水平(p=0.009)、腹水量(p=0.029)、网膜转移(p=0.012)及铂敏感性(p=0.049)显著相关。与患者的FIGO分期(p=0.108)及淋巴结转移不相关(p=0.92)。 4.构建SF3B4稳定过表达细胞系及敲除细胞系 选择卵巢癌SKOV3细胞系建立稳定过表达SF3B4的细胞系，qRT-PCR及WesternBlot检测其过表达效果，结果显示，SF3B4过表达约5倍。选择卵巢癌HEY细胞系建立SF3B4稳定敲减细胞系。qRT-PCR及WesternBlot检测了其敲减效率，结果显示SF3B4mRNA表达下降约90％，蛋白表达下降约70％。 5.SF3B4促进卵巢癌细胞体外增殖及克隆形成能力 体外MTT细胞增殖实验结果显示，在卵巢癌HEY、SKOV3及A2780细胞系中敲减SF3B4后，自第3天开始增殖速度明显下降(P＜0.05)。在SKOV3中过表达SF3B4后，其增殖速度自第2天开始明显提高(P＜0.05)。EdU结果显示，敲除SF3B4后，卵巢癌细胞分裂增殖细胞比例较对照组减少约15％，过表达SF3B4后，其分裂增殖细胞比例较对照组增加约15％。平板克隆形成实验同样提示，敲减SF3B4明显削弱HEY及SKOV3细胞的克隆形成能力，过表达SF3B4后其克隆形成能力明显增强(P＜0.05)。 6.SF3B4促进卵巢癌细胞体外迁移及侵袭能力 体外transwell迁移及侵袭实验结果显示，在卵巢癌细胞系中敲除SF3B4后，其穿膜细胞数约为对照组的40％-60％;过表达SF3B4后，其穿膜细胞数约为对照组的2-3倍，差异均有统计学意义。 7.SF3B4促进卵巢癌细胞裸鼠体内成瘤能力 体内实验结果表明，敲减SF3B4后卵巢癌细胞异种皮下成瘤能力明显减弱。SF3B4敲减组小鼠皮下肿瘤的重量(0.177gvs0.385g)及体积（0.13cm3vs0.36cm3）明显低于对照组。免疫组化结果表明SF3B4敲减组Ki-67的表达量明显低于对照组。 研究结论 SF3B4在卵巢癌中高表达，且与患者的不良预后相关。在体内、外促进卵巢癌细胞的恶性行为。有望成为卵巢癌患者预后的分子标志物及药物治疗的靶点。 第二部分卵巢癌中SF3B4下游剪接事件的筛选与功能研究 研究目的 RNA结合蛋白通过调控下游靶基因的有效剪接而影响其表达水平。本部分拟通过高通量测序技术筛选SF3B4调控的下游靶基因及参与的剪接事件，探索SF3B4在卵巢癌中发挥促癌作用的机制。并探讨其靶基因对卵巢癌生物学功能的影响。 研究方法 应用SF3B4小干扰RNA(siRNA)及对照siRNA瞬时转染卵巢癌HEY细胞系，提取其mRNA，应用qRT-PCR验证SF3B4siRNA干扰效率。在保证干扰效率的前提下，收取剩余样本的mRNA送高通量测序分析(RNA-seq)，通过测序结果的差异表达基因(DEGs)分析及可变剪接事件(AS)分析，筛选并确定SF3B4在卵巢癌中可能调控的靶基因。 应用qRT-PCR对部分DEGs进行调控关系验证。使用R语言及rMATS软件进行可变剪接事件的分析及可视化。应用Ensembl网站进行靶基因不同转录本之间序列的比对。根据基因序列比对结果设计靶基因不同转录本的特异性RT-PCR引物。通过RT-PCR实验进一步验证SF3B4对靶基因的剪接效率变化及对靶基因不同转录本表达量的影响。应用RNA结合蛋白免疫沉淀技术(RIP)拉下与SF3B4结合的mRNA，并通过qRT-PCR验证SF3B4与靶基因mRNA的结合效率，证实SF3B4与靶基因mRNA的直接结合。应用qRT-PCR及WesternBlot验证SF3B4敲减后下游靶基因mRNA及蛋白水平的变化。 应用TCGA-GTEX数据库数据分析靶基因不同转录本在卵巢癌中的表达量，及其与SF3B4表达水平的相关性。应用K-M软件分析靶基因主要转录本与卵巢癌病人生存预后的关系。 应用针对靶基因的siRNA及对照siRNA瞬时转染卵巢癌细胞系，qRT-PCR验证其对靶基因mRNA的干扰效率，WesternBlot验证其对靶基因蛋白水平的敲减效率，选取干扰效率满意的2条siRNA进行功能实验研究。体外通过MTT、EdU、平板克隆、Transwell实验验证靶基因对卵巢癌细胞增殖及侵袭能力的影响。在SF3B4稳定过表达的SKOV3细胞系及对照组细胞系中，应用靶基因的siRNA敲减靶基因的表达水平进行Rescue实验。体外通过MTT、EdU细胞增殖实验以及Transwell实验检测敲低靶基因后对SF3B4促进卵巢癌细胞增殖及侵袭能力的影响。 研究结果 1.RNA-seq测序结果分析及验证 RNA-seq结果显示，在卵巢癌HEY细胞系中干扰SF3B4后共有DEGs1166个，其中665个上调，501个下调。GO分析显示DEGs主要向转录调控、细胞粘附、细胞外基质组成、细胞生长调控等生物学过程富集。KEGG分析显示DEGs主要向DNA复制、细胞周期、TNF信号通路等富集。qRT-PCR验证DNA复制通路中5个分子在SF3B4敲低后mRNA水平的变化，结果显示DNA2，MCM6，POLA1，RFC3，PRIM1mRNA水平在SF3B4敲低后较对照组明显降低，与RNA-seq结果一致。 2.卵巢癌中SF3B4下游靶基因的筛选 RNA-seq结果显示，在卵巢癌HEY细胞系中干扰SF3B4后共有3524项剪接事件的变化，外显子跳跃和内含子保留占主导地位，其中外显子跳跃2376项，内含子保留320项。将SF3B4干扰后有剪接变化的基因与TCGA数据库中卵巢癌差异表达基因取交集，共得到940个目的基因。因既往研究表明，SF3B家族成员可参与内含子保留事件。故我们进一步分析了SF3B4干扰后内含子保留事件(p＜0.05，|delInclevel|＞0.1)与TCGATARGETGTEx数据库中与SF3B4表达正相关(Pearsonr≥0.4，p＜0.05)的基因取交集，得到27个目的基因。 qRT-PCR验证了HEY细胞系中敲低SF3B4后27个目的基因mRNA水平的变化，结果显示DDX11，FNBP1L，PITPNM1，DDX51，PKD1和RAD52明显下调(p＜0.05)。RAD52参与DNA损伤修复且RAD52的小分子抑制剂能够改善BRCA缺陷的恶性肿瘤的治疗效果。故我们选取RAD52为进一步研究对象。 3.SF3B4调控RAD52的可变剪接 R语言及rMATS软件分析可视化结果显示，在SF3B4敲低后，RAD52发生了明显内含子保留事件。Ensembl网站查询分析结果显示，其内含子保留位置位于转录本202的第8个内含子区域。RT-PCR结果显示，在卵巢癌细胞系中敲低SF3B4后，RAD52-202的表达量明显降低，相反RAD52-206的表达量明显升高。RIP-PCR结果显示SF3B4能够拉下RAD52的mRNA。qRT-PCR及WesternBlot结果显示，卵巢癌细胞中敲低SF3B4后RAD52mRNA及蛋白表达水平明显下降。 4.RAD52在卵巢癌中高表达且与不良预后相关 TCGA-GTEX数据库分析结果显示卵巢癌中RAD52-202转录本（剪接）mRNA的表达较正常卵巢及输卵管上皮明显升高，而其RAD52-206转录本（未剪接）mRNA表达明显降低。且RAD52-202mRNA的表达与卵巢癌患者的OS显著相关(p=0.0095)。 5.构建RAD52稳定过表达细胞系及敲除细胞系 选择卵巢癌HEY细胞系建立RAD52稳定过表达细胞系，结果显示，RAD52mRNA及蛋白水平过表达约300倍。在卵巢癌HEY、A2780及SKOV3细胞系中应用siRNA敲减RAD52。qRT-PCR及WesternBlot的方法检测了其敲减效率，结果显示RAD52mRNA表达下降约70％，蛋白表达下降约90％。 6.RAD52在体外促进卵巢癌细胞的增殖能力 体外MTT细胞增殖实验结果显示，在卵巢癌HEY、SKOV3及A2780细胞系中敲减RAD52后，自第2天开始增殖速度明显下降(P＜0.05)。EdU结果显示，敲除RAD52后，卵巢癌细胞分裂增殖细胞比例较对照组明显减少(P＜0.05)。平板克隆实验结果表明，敲减RAD52后，卵巢癌细胞克隆形成能力下降约50％。 7.RAD52在体外促进卵巢癌细胞的侵袭能力 体外transwell迁移及侵袭实验结果显示，在卵巢癌细胞系中敲除RAD52后，其穿膜细胞数较对照组下降约50％(P＜0.05)。 8.敲除RAD52能够削弱SF3B4对卵巢癌细胞生物学功能的促进作用 我们应用卵巢癌SKOV3细胞系构建了SF3B4及RAD52不同表达状态的4组细胞进行功能拯救实验，结果显示，敲减RAD52后可明显削弱SF3B4过表达引起的卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的增强。 研究结论 SF3B4在卵巢癌中参与剪接事件的调控，其表达的上调提高了对RAD52mRNA的剪接效率。RAD52在浆液性卵巢癌中表达上调，并能促进卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力。敲减RAD52后能削弱SF3B4对卵巢癌细胞增殖、侵袭的促进能力。在浆液性卵巢癌中，SF3B4通过调控RAD52而发挥促癌作用。 第三部分卵巢癌中SF3B4上游调控机制研究 研究目的 基因本身拷贝数的扩增可导致其表达量增高，基因转录水平及转录后水平的调控同样对其表达量起重要的调控作用。microRNA通过结合靶基因mRNA3''UTR进行转录后水平的调节。转录因子通过作用于靶基因启动子区域进行转录水平的调节。本部分拟阐明SF3B4上游调控分子，以探究其在卵巢癌中高表达的分子机制，并验证其上游调控分子对卵巢癌生物学行为的影响。 研究方法 通过StarBase数据库在线预测可能结合SF3B4mRNA的miRNAs。通过GSE47841数据库分析卵巢癌中明显下调的miRNAs。结合二者分析结果筛选可能调控SF3B4表达的上游miRNAs。通过数据库预测上游miRNA与SF3B4的具体结合位点，构建SF3B43''UTRmiRNA结合位点的野生及突变载体。应用双荧光素酶报告基因证实上游miRNA可否直接结合SF3B4mRNA。 qRT-PCR验证miRNAmimics瞬时转染后对其本身的过表达效率。qRT-PCR验证miRNAmimics瞬时转染后对卵巢癌细胞系SF3B4mRNA表达水平的影响。WesternBlot进一步验证miRNAmimics瞬时转染后对卵巢癌细胞系SF3B4蛋白水平的调控作用。 在体外通过MTT及EdU细胞增殖实验、平板克隆形成实验验证上游miRNA对卵巢癌细胞增殖能力的影响，通过Transwell实验验证上游miRNA对卵巢癌细胞迁移及侵袭能力的影响。在卵巢癌SKOV3细胞系中共同瞬时转染miRNAmimics及SF3B4载体，验证SF3B4过表达是否能够拯救miRNAmimics对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。 通过AnimalTFDB3.0数据库在线预测可能与SF3B4启动子区域结合的转录因子。通过TCGA数据库分析与SF3B4表达呈显著相关的基因。结合二者分析结果筛选可能调控SF3B4表达的上游转录调控因子。构建SF3B4启动子区域全长载体，应用双荧光素酶报告基因实验验证上游转录调控因子对SF3B4启动子区域的转录调控作用。 构建上游转录调控因子稳定过表达及敲减细胞系，qRT-PCR及WB验证其对本身的过表达及敲减效率，并验证其敲除后对SF3B4mRNA及蛋白的影响。 在体外通过MTT及EdU细胞增殖实验、平板克隆形成实验验证上游转录调控因子对卵巢癌细胞增殖能力的影响，通过Transwell实验验证上游转录调控分子对卵巢癌细胞迁移及侵袭能力的影响。在上游转录调控因子稳定过表达的HEY细胞系及对照组细胞系中，应用SF3B4的siRNA敲减SF3B4的表达水平进行拯救实验，通过MTT细胞增殖实验及Transwell实验验证敲除SF3B4是否能够削弱上游转录调控因子对卵巢癌细胞恶性生物学行为的促进作用。 研究结果 1.SF3B4上游转录后水平调控分子的筛选及验证 StarBase数据库在线预测共有34个miRNA可能与SF3B4mRNA3''UTR直接结合。GSE47841数据库分析显示共有121个miRNA在卵巢癌中表达明显下调。综合以上两个数据库的结果发现，仅miR-509-3p符合筛选条件。双荧光素酶报告基因结果显示miR-509-3p能够显著降低SF3B4mRNA3''UTR野生型载体的荧光活性。 2.miR-509-3p负性调控SF3B4的表达 qRT-PCR结果显示瞬时转染miR-509-3pmimics后miR-509-3p的表达水平显著升高。qRT-PCR及WesternBlot结果显示瞬时转染miR-509-3pmimics可显著下调卵巢癌细胞系SF3B4mRNA及蛋白的表达水平。 3.miR-509-3p在体外抑制卵巢癌细胞增殖能力 体外MTT及EdU细胞增殖实验结果显示，在卵巢癌HEY、SKOV3及A2780细胞系中瞬转miR-509-3pmimics后，卵巢癌细胞增殖明显减弱，差异显著。平板克隆实验提示，miR-509-3p能够显著降低卵巢癌细胞的克隆形成能力(P＜0.05)。 4.miR-509-3p在体外抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭能力 Transwell实验结果显示，瞬时转染miR-509-3p后，卵巢癌细胞的穿膜数目明显减少(P＜0.05)。 5.SF3B4能够拯救miR-509-3p对卵巢癌细胞增殖及侵袭的抑制作用 我们应用卵巢癌SKOV3细胞系构建了miR-509-3p及SF3B4不同表达状态的4组细胞进行功能拯救实验，结果显示，过表达SF3B4后可明显拯救miR-509-3p对卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用。 6.SF3B4上游转录水平调控分子的筛选及验证 AnimalTFDB3.0数据库在线预测共有509个转录因子可能与SF3B4启动子区域结合，TCGA数据库分析显示共有32个基因与SF3B4表达呈正相关。综合以上两个数据库的结果发现，仅SETDB1符合筛选条件。双荧光素酶报告基因结果显示SETDB1能够显著增强SF3B4启动子区域载体的荧光活性。 7.SETDB1正性调控SF3B4的表达 选择卵巢癌HEY细胞系建立SETDB1稳定过表达细胞系，并用SETDB1siRNA构建SETDB1敲减细胞系。qRT-PCR及WesternBlot方法检测了其过表达及敲减效率，结果显示，SETDB1过表达约6倍。敲除SETDB1后其mRNA及蛋白表达水平下降约60％-80％，SF3B4mRNA及蛋白表达水平下降约30％-50％。 8.SETDB1在体外促进卵巢癌细胞增殖能力 体外MTT细胞增殖实验结果显示，在卵巢癌HEY、SKOV3及A2780细胞系中敲减SETDB1后，自第3天开始增殖速度明显下降(P＜0.05)。在HEY细胞系中过表达SETDB1后，其增殖速度自第3天开始明显提高(P＜0.05)。EdU结果显示，敲除SETDB1后卵巢癌细胞分裂增殖比例较对照组减少约10％-15％。克隆形成实验结果提示，敲减SETDB1后卵巢癌细胞克隆形成能力下降约50％。 9.SETDB1促进卵巢癌细胞体外迁移及侵袭能力 体外Transwell迁移及侵袭实验结果显示，在卵巢癌细胞系中敲除SETDB1后，其穿膜细胞数较对照组下降约50％(P＜0.05)。 10.敲除SF3B4能够削弱SETDB1对卵巢癌细胞生物学功能的促进作用 我们应用卵巢癌HEY细胞系构建了SETDB1及SF3B4不同表达状态的4组细胞进行功能拯救实验，MTT及Transwell实验结果显示，敲减SF3B4后可明显削弱SETDB1过表达引起的卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的增强。 研究结论 miR-509-3p在卵巢癌中表达下调，且与SF3B4mRNA直接结合，负性调控其表达。miR-509-3p抑制卵巢癌细胞的恶性行为，且SF3B4能够拯救其对卵巢癌细胞恶性行为的抑制作用。SETDB1在卵巢癌中表达上调，且与SF3B4启动子区域相互作用正性调控其表达。SETDB1促进卵巢癌细胞的恶性行为，且抑制SF3B4能够削弱其对卵巢癌细胞恶性行为的促进作用。
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