摘要
研究目的 (1)筛选结直肠癌(colorectalcancer，CRC)患者和健康志愿者(Healthydonors，HD)的血清外泌体中差异表达的长链非编码RNA(Longnon-codingRNAs，LneRNAs)，评价其作为CRC和早期CRC诊断的生物标志物的诊断效能。 (2)研究lncRNA-FOXD2-AS1对CRC细胞增殖、细胞克隆形成、细胞划痕、细胞迁移等恶性生物学行为的影响。 (3)验证外泌体能够携带并传递FOXD2-AS1给人脐静脉融合细胞(EA.hy926)，并促进EA.hy926细胞的迁移、侵袭和血管形成的能力。 研究方法 (1)首先利用超高速离心法获得CRC患者和健康志愿者的血清外泌体，使用透射电镜、qNano以及蛋白免疫印迹法(Westernblot)分别对提取的外泌体的形态、大小和表面标志性蛋白(CD9和TSG101)进行检测。 (2)利用lncRNAs微阵列芯片技术检测并统计分析4例CRC患者和2例健康志愿者间差异表达的外泌体lncRNAs(ExlncRNAs)。分析结果，选取其中16个lncRNAs(Foldchange≥2.0和P＜0.05)进行引物设计，选取引物特异性好的lncRNAs采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)在48例CRC患者和48例健康志愿者中验证基因的表达差异性，最终选取FOXD2-AS1、NRIR和XLOC_009459三个目的基因。 (3)提取CRC患者血清外泌体，使用RNAseA酶处理或在室温下放置不同时间，提取外泌体RNAs并检测FOXD2-AS1、NRIR和XLOC_009459的表达量变化，验证外泌体lncRNAs的稳定性。 (4)提取203例CRC患者、203例健康志愿者和20例结直肠良性疾病(benignintestinaldiseases，BD)患者的血清外泌体总RNAs，对目的基因采用qRT-PCR技术进行定量统计分析，筛选出应用于CRC和早期CRC诊断的生物标志物，同时制作ROC曲线以评估三个lncRNAs的单一和联合的诊断效能。 (5)查阅并记录CRC患者病例信息和临床病理特征参数，如年龄、性别、饮酒史、糖尿病史、病理分化程度、肿瘤位置、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期等。根据AJCC临床肿瘤分期标准对CRC患者进行病理分期。分析FOXD2-AS1、NRIR和XLOC_009459的表达水平与CRC患者常见临床病理特征之间的相关性。 (6)构建FOXD2-AS1的过表达质粒和小干扰RNA，分别在CRC细胞中过表达和敲低FOXD2-AS1，应用CCK8细胞增殖实验、细胞克隆球形成实验、细胞划痕实验、细胞迁移等实验，研究其对CRC细胞的增殖、克隆形成能力及迁移能力的影响。 (7)使用FOXD2-AS1的过表达质粒转染SW480细胞后提取细胞上清中的外泌体孵育EA.hy926细胞，研究其对EA.hy926细胞迁移、侵袭和血管形成能力的影响。 研究结果 (1)外泌体FOXD2-AS1、NRIR和XLOC_009459(TCONS00020073)在203例CRC患者和80例早期CRC患者中的表达水平显著高于201例健康志愿者，通过受试者工作特征曲线（Rece-iveroperatingcharacteristic，ROC曲线）结果显示，在CRC患者中，三种LncRNAs的AUC分别为0.728、0.660和0.682，三者联合诊断AUC为0.736。在早期CRC患者中三种LncRNAs的AUC分别为0.743、0.660和0.689，联合诊断AUC为0.758，结果表明外泌体FOXD2-AS1、NRIR和XLOC009459是有潜力的CRC诊断及早期诊断的生物标志物。 (2)转染FOXD2-AS1小干扰后能抑制CRC细胞的增殖、克隆形成及迁移能力。转染FOXD2-AS1过表达质粒后可以增强CRC细胞的增殖、克隆形成及迁移能力。 (3)使用FOXD2-AS1的过表达质粒转染SW480细胞后提取细胞上清中的外泌体孵育EA.hy926细胞，可以增强EA.hy926细胞的迁移、侵袭和血管形成能力。 研究结论 (1)血清外泌体FOXD2-AS1、NRIR和XLOC_009459可以作为CRC诊断及早期诊断的有前景的生物标志物，三种目的基因联合用于CRC诊断及早期诊断具有较高的诊断效能。 (2)FOXD2-AS1可以促进CRC细胞的增殖、克隆形成及迁移能力。 (3)外泌体可以携带FOXD2-AS1并传递给EA.hy926细胞，并促进EA.hy926细胞的迁移、侵袭及血管形成的能力。
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