摘要
目的:大气细颗粒物(PM2.5)可诱导哮喘急性发作，寻找调控靶点具有重要意义，其中气道上皮细胞(AEC)焦亡是关键靶标。细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物释放进而激活更强炎症反应，与PM2.5破坏AEC屏障密切相关。克拉拉细胞蛋白16(CC16)以往用于监测肺-血屏障，流行病学研究显示哮喘患者血清CC16水平降低，动物模型证实CC16调控Caspase-1等焦亡信号通路进而保护肺损伤。我们前期也证实CC16对AEC焦亡有拮抗作用。在此基础，我们用PM2.5暴露致AEC细胞焦亡及哮喘急性发作动物模型，在体内外验证CC16对哮喘急性发作AEC屏障损伤的干预作用。 方法:于2020年8月1日～10月15日期间，在中国科学院广州地球化学研究所距离广园路100m的屋顶上，采用美国TISCH大流量大气采样器，使用Tissuquartz纤维滤膜采集大气中PM2.5,将载有颗粒物纤维滤膜经超声震荡、洗涤、离心、冻干制备PM2.5冻干粉及混悬液;对PM2.5采用电感耦合等离子体质谱和IC离子色谱进行离子色谱、水溶性总有机碳和水溶性金属的组成分分析。C57BL/6J小鼠在第1、7、14天腹腔注射10％卵清蛋白(OVA)致敏、第21～27天经气道雾化2％OVA激发建立哮喘小鼠模型。哮喘小鼠用PM2.5(2mg/kg)气道雾化暴露2小时，24小时后用CC16(2mg/kg)雾化治疗2小时。模型分别采集腹主动脉血进行血气分析;Buxco无创肺功能测试系统测量小鼠气道反应性(sRaw)和吸气峰压力(PIF);哮喘小鼠肺组织病理切片HE染色进行Smith肺损伤程度评估;免疫组化及免疫印迹(WB)检测炎症信号通路及焦亡信号通路的表达变化。PM2.5预先在高压蒸汽灭菌20分钟后成分分析及建立细胞模型。在BEAS-2B气道上皮细胞系中，细胞预先在高压灭菌后PM2.5(100μg/mL)暴露于24小时，再添加CC16(0.25μg/mL、0.5μg/mL和1.0μg/mL)处理24小时。两种干预细胞模型采用CCK-8计算细胞存活数量;采用AnnexinⅤ-FITC/PI/Hoechst33342荧光染色联用共聚焦显微镜分析细胞焦亡比例;采用扫描电子显微镜评估细胞焦亡形态学改变;采用WB和实时聚合酶链式反应(PCR)检测炎症信号通路和焦亡信号通路的表达变化;基于RNA转录组学分析参与CC16调控的差异性基因。 结果:质谱分析提示高压蒸汽灭菌前后PM2.5的元素含量构成基本一致，前五位含量是总有机碳、Ca、Na、K和Zn，微量元素组成中前五位是Cu、Mn、Ba、As和Pb，水溶元素组成中前五位阳离子是NH4+、Ca2+、K+、Na+和Mg2+;前五位阴离子是;SO42-、NO3-、C1-、NO2-和Br-。PM2.5暴露后急性哮喘小鼠出现呼吸性酸中毒:pH下降(7.16±0.07比7.40±0.04，P=0.02)、sRaw和PIF上升，HE肺组织病理提示M2.5暴露后出现中性粒细胞浸润、弥漫性肺泡出血。免疫组化与WB结果提示炎症信号通路与焦亡信号通路均参与PM2.5暴露所激活哮喘急性发作过程，表现为磷酸化的NF-κB、Caspase-3剪切体、Caspase-1剪切体和IL1β剪切体等表达均较对照组上调。但是，CC16的干预能改善PM2.5暴露后肺损伤病理程度、PO2回升(136.00±31.59mmHg比80.00±26.25mmHg，P=0.01)、pH上升(7.22±0.09比7.16±0.07，P=0.08)和PCO2降低(49.50±21.84mmHg比63.25±12.97mmHg，P=0.66)。气道阻力sRaw与PIF下降至未暴露前基线。PM2.5暴露后BEAS-2B细胞存活减少且细胞膜完整性破坏，伴有炎症和焦亡的下游信号激活;经CC16处理后BEAS-2B细胞增殖增加，并且细胞的形态学恢复索形和细胞膜的完整性得以恢复。WB分析显示，在两种模型中，CC16作用靶点在于抑制了PM2.5暴露后上调磷酸化的Caspase-3剪切体、Caspase-1剪切体和IL1β剪切体的表达。基于转录组学我们发现CC16激活细胞增殖及修复相关的基因，如ETS1，PSMD2和EIF3A等;抑制的主要是粘附及脂类代谢相关的基因，如AGPTL4，ICAM1和CPT1等。 结论:CC16通过激活细胞增殖、抑制炎症粘附等基因表达，调控NF-κB炎症通路和Caspase-1-GSDMD-IL1β焦亡途径，从而修复PM2.5暴露后气道上皮细胞损伤，进而纠正PM2.5诱导哮喘急性发作模型的呼吸性酸中毒及呼吸窘迫，提示其可能具有治疗哮喘急性发作的应用前景。
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