摘要
研究背景 瘢痕疙瘩（keloid）是一种以细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）过度沉积为显著特征的皮肤纤维增生性疾病，其发生发展与遗传易感性、免疫失调、表观遗传学、胶原合成及降解异常等因素有关。众多研究表明，瘢痕疙瘩的发病及ECM相关成分过度沉积主要依赖于成纤维细胞中的信号通路级联反应，但。肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子（tumornecrosisfactor-likeweakinducerofapoptosis，TWEAK）是一种肿瘤坏死因子配体超家族成员的细胞因子，与其同源受体Fn14结合发挥作用。既往研究表明TWEAK/Fn14是介导细胞凋亡的重要通路，并且还在细胞增殖、细胞外基质重塑、炎症等方面发挥作用。但TWEAK/Fn14信号通路在瘢痕疙瘩发生发展中是否发挥作用目前尚无深入的研究。 研究目的 本研究拟评估TWEAK/Fn14信号通路在瘢痕疙瘩中的表达水平，验证TWEAK/Fn14信号通路在瘢痕疙瘩中发挥的功能与作用，最后明确TWEAK/Fn14信号通路发挥作用的分子机制。 研究方法 通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色，比较瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中TWEAK和Fn14的表达和定位差异;利用qPCR和免疫印迹分析瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中TWEAK的mRNA和蛋白水平差异;从新鲜的真皮组织中分离原代成纤维细胞，利用qPCR和免疫印迹分析瘢痕疙瘩和正常皮肤组织成纤维细胞中Fn14的mRNA和蛋白水平表达差异;收集多发性瘢痕疙瘩患者和正常人血清，利用ELISA分析血清中TWEAK的表达差异。使用人TWEAK重组蛋白刺激瘢痕疙瘩组织来源的原代培养成纤维细胞，同时利用siRNA构建Fn14敲低的成纤维细胞株，采用qPCR、免疫印迹、免疫荧光染色、CCK8、EdU以及流式细胞术等实验方法，分别检测激活和抑制TWEAK/Fn14信号通路对成纤维细胞ECM相关蛋白合成、细胞增殖及凋亡的影响。通过转录组测序分析激活或抑制成纤维细胞中TWEAK/Fn14信号通路后转录因子的改变，采用ChIP-qPCR及荧光素酶报告实验检测关键转录因子干扰素调节因子1（interferonregulatoryfactor1，IRF1）的转录调控作用。通过查阅文献及转录因子数据库预测，推测TWEAK/Fn14信号通路上调IRF1的介导分子是P65，并用qPCR、免疫印迹和免疫荧光验证TWEAK/Fn14信号通路对P65的激活作用。采用qPCR、免疫印迹和免疫组织化学染色在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中验证TWEAK/Fn14信号通路及其下游关键转录因子的表达及其与ECM相关分子等基因的相关性。 研究结果 在瘢痕疙瘩中，瘢痕疙瘩组织及患者血清TWEAK表达显著下调，瘢痕疙瘩成纤维细胞中Fn14受体表达显著下调;人TWEAK重组蛋白处理瘢痕疙瘩成纤维细胞显著降低了胶原等细胞外基质蛋白的表达，而Fn14siRNA转染成纤维细胞后则促进胶原等细胞外基质蛋白的表达;转录组测序表明人TWEAK重组蛋白的补充及Fn14的敲低会分别上调IRF1和下调IRF1的表达，提示IRF1可能是介导TWEAK/Fn14信号通路负向调控成纤维细胞中细胞外基质的关键转录因子。我们在成纤维细胞中敲低IRF1后，发现细胞外基质相关蛋白显著升高。通过JASPAR数据库预测IRF1的转录因子及查阅文献，我们推测TWEAK/Fn14信号通路上调IRF1是P65介导的，ChlP-qPCR及双荧光素酶报告实验证实了P65在IRF1启动子区域的结合位点。同时，我们在成纤维细胞中敲低P65后，发现细胞外基质相关蛋白显著升高。最后，我们明确了瘢痕疙瘩中，TWEAK、Fn14、IRF1的表达，两两之间呈正相关关系，而这三个分子与胶原的表达呈负相关关系。 研究结论 在瘢痕疙瘩中，TWEAK/Fn14信号通路被抑制，TWEAK/Fn14信号通路通过调控P65活性来调控IRF1的表达，从而对瘢痕疙瘩成纤维细胞中细胞外基质相关蛋白的合成发挥作用，最终影响瘢痕疙瘩的发生发展。本研究简要阐明了TWEAK/Fn14信号通路在瘢痕疙瘩中的功能及其分子调控机制，对进一步阐明瘢痕疙瘩发病机制，寻找新的防治靶点具有重要意义。
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