摘要
近年来，随着人类活动的不断加剧，海洋生物入侵事件频发，严重威胁海洋生态系统的健康和稳定，同时给水产养殖、船舶运输、水利设施建设等重要行业也带来巨大经济损失。分析海洋生物入侵过程不难发现，生物黏附在海洋生物入侵的转运、引入和定殖三个阶段都发挥了重要的作用。因此，如何有效防止海洋生物黏附对避免海洋生物入侵灾害的发生至关重要。然而海洋生物黏附是一个复杂的过程，通常依赖其特异性黏附器官和大量黏附蛋白，涉及生物相(黏附器官或组织)与非生物相(水下基质材料)的相互作用。 海洋黏附生物种类繁多，黏附机制多样。欲全面揭示海洋生物黏附机制，应开展更多代表性黏附物种的研究，总结黏附共性和个性特征。本研究以代表性入侵生物玻璃海鞘(Cionarobusta)为研究对象，紧紧围绕玻璃海鞘黏附的匍匐枝结构及关键黏附蛋白的界面黏附机制这一重要科学问题，分析匍匐枝的外部形态、内部结构和黏附界面特征，探究匍匐枝蛋白组成及其黏附机制。试图通过多学科交叉研究，深入解析玻璃海鞘匍匐枝黏附的结构基础，筛选关键黏附蛋白组分并阐明界面黏附机制。本研究主要取得以下结果: (1)全面剖析了玻璃海鞘匍匐枝的结构特征。首先，体视镜观察证实了玻璃海鞘匍匐枝是由腹部延伸出的形状不规则的表皮突起。其次，通过组织染色方法、显微技术确定了匍匐枝的结构层次以及被囊中嵌有特殊的管状结构。在此基础上利用电镜技术证实了匍匐枝表皮细胞、匍匐状血管以及类腺体结构均参与匍匐枝被囊的形成，被囊中的分泌小泡是匍匐枝黏附的关键物质。最后，总结了玻璃海鞘黏附物质可能的合成与分泌途径及玻璃海鞘的黏附过程，揭示了玻璃海鞘匍匐枝的结构特征以及黏附物质合成与分泌途径，为后续黏附物质的分离、鉴定和筛选提供结构基础。 (2)在匍匐枝结构明确的基础上，发现了玻璃海鞘匍匐枝中含有大量与黏附功能相关的蛋白组分。蛋白质谱分析在玻璃海鞘匍匐枝中共鉴定到1514种蛋白，其中337种蛋白在黏着斑中同样被鉴定到。其次，揭示了匍匐枝黏附分子机制的复杂性。蛋白组学技术鉴定到大量差异表达蛋白，功能富集分析将差异表达蛋白富集到了多条与黏附功能相关的通路。最后，根据海洋黏附蛋白的共性结构特征，从匍匐枝中筛选到了6种玻璃海鞘候选黏附蛋白，并成功在体外重组表达并纯化出4种具有生物活性蛋白AAP3、AAP4、AAP5和AAP6。重组黏附蛋白为后续验证黏附蛋白的功能、揭示黏附蛋白作用的分子机制提供了实验材料。 (3)根据蛋白特征分析结果，深入分析AAP5蛋白的黏附功能，从分子层面揭示了玻璃海鞘匍匐枝黏附机制。利用免疫组化、免疫荧光技术证实了AAP5蛋白在匍匐枝、外套膜和被囊中均有分布。实时定量PCR和WesternBlot分析表明，AAP5蛋白编码基因在匍匐枝和外套膜中的表达水平分别是肌肉组织的3.92和3.09倍，揭示了AAP5蛋白在玻璃海鞘中的合成过程。AAP5蛋白结构分析发现TSP-1是其重要的功能结构域，利用原子力显微镜结合数学建模计算，验证了AAP5蛋白的黏附性能，且TSP-1结构域多肽黏附力是AAP5蛋白的2.5倍，去除TSP-1结构域后的AAP5蛋白黏附力约减少14nN，揭示了TSP-1是AAP5蛋白黏附的关键结构域。最后，通过玻璃包被和海上黏附实验，证实了玻璃海鞘匍匐枝黏附对于不同基质具有选择性。 (4)玻璃海鞘匍匐枝黏附响应温度和盐度胁迫研究证实大量匍匐枝蛋白参与响应温度和盐度胁迫的过程。与对照组相比，在低盐、高盐、低温和高温胁迫条件下分别从玻璃海鞘匍匐枝中鉴定出75、86、123和83个差异表达蛋白。匍匐枝蛋白应对不同胁迫的响应机制不同。细胞骨架、信号转导和翻译后修饰通路共同响应温度和盐度两种胁迫，这些通路有助于匍匐枝结构的稳定、蛋白质的合成和胁迫反应的激活。在低盐胁迫下，细胞外基质在调节细胞信号转导和蛋白质合成方面发挥作用。匍匐枝可以通过激活碳水化合物/脂质运输和分解代谢储存更多能量应对高盐胁迫。此外，匍匐枝可以通过脂质代谢产生的能量抵御低温胁迫;通过调控细胞周期抑制细胞生长保存更多能量以应对高温胁迫。以上研究结果揭示了玻璃海鞘匍匐枝对温度和盐度胁迫响应的潜在分子机制。 本研究从玻璃海鞘黏附器官匍匐枝结构基础和分子机制两个层面上探讨了入侵生物玻璃海鞘匍匐枝黏附过程，筛选鉴定出了关键的候选黏附蛋白，揭示了玻璃海鞘黏附器官的结构特征和关键黏附蛋白组分的界面黏附机制。这些研究结果为海洋生物入侵等灾害事件治理提供理论支撑，同时也能为深入了解海洋生物黏附机制提供了科学数据补充，兼具科学意义和应用价值。
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