摘要
研究目的： 本课题探究降钙素基因相关肽（CGRP)在人增生性瘢痕和小鼠皮肤瘢痕中表达情况；同时建立小鼠全层皮肤切除创面愈合模型，研究降钙素基因相关肽（CGRP)对增生性瘢痕形成和炎症免疫反应的影响。此外，应用脂多糖（LPS)诱导的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs)来探索CGRP在炎症反应调节中的作用及其潜在机制。最终探讨降钙素基因相关肽（CGRP)在增生性瘢痕中的作用及其潜在机制。 研究方法： 1)患者和标本 本研究选取2016年至2019年在安徽医科大学第一附属医院整形外科招募增生性瘢痕患者，所有患者均知情同意并签署相关文件。从接受整形手术的患者收集增生性瘢痕和增生性瘢痕周围的正常皮肤组织，放置于-80℃冰箱中新鲜储存，用于酶联免疫吸附测定（ELISA)和蛋白质印迹测定（WB，WesternBlot)。本研究获得安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。 2)动物实验设计 本实验选用6-8周成年C57BL/6小鼠，其购自SLAC公司（中国，上海）。将动物皮肤切除小鼠模型饲养在温度和湿度控制条件下（温度为22-24C，湿度为60±5%)。建模，首先用戊巴比妥钠（剂量为50mg/kg)腹腔注射麻醉动物；接下来，对小鼠背侧皮肤进行剃毛、消毒和铺巾，使用外科手术刀去除整个表皮、真皮、筋膜层形成一个全层圆形皮肤伤口（直径1cm)。手术后，立即给小鼠施用200μl(总共四个方向中每个方向50μl)磷酸盐缓冲盐水（PBS)、CGRP(10μM)溶液以及CGRP(8-37)(10μM)溶液在伤口组织周围皮下注射。CGRP和CGRP(8-37)均溶解于磷酸盐缓冲盐水（PBS)中。在接下来的7天内，每24小时重复注射一次（注射溶液和方式同上）。CGRP和CGRP(8-37)购自Genescriptamp;nbsp;公司（中国，南京）。实验期间，在术后第2、5、10天用数显卡尺测量伤口面积。另外，在指定的时间点（第5天和第10天）以脊椎脱臼法处死小鼠，取出伤口组织存放于-80℃冰箱中，用于进一步测定后续指标，并收集来自未受伤健康小鼠的背部皮肤作为正常皮肤对照组。动物实验研究经安徽医科大学第一附属医院伦理承诺审查批准。 3)细胞培养和处理 从成年C57BL/6小鼠中分离出骨髓分化的巨噬细胞（BMDMs)。将提取的BMDMs细胞培养在含有10%胎牛血清(FBS,Gibco)和巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(10ng/ml)的DMEM培养基中培养5天。接着，在PBS或CGRP(2μM)存在下，用LPS(1μg/ml)刺激细胞1小时。 4)流式细胞计数 ①组织处理 实验结束后，处死小鼠，将创面组织收集在有3%FBS的冷TOS中并用3%FBS洗涤两次。然后，将组织切碎并在DMEM+胶原酶I(4mg/ml)中（温度设置在37C下）振荡30分钟。接着，研磨组织，使用70μm过滤器过滤细胞。然后，将细胞洗涤并悬浮在PBS+2%FBS中。 ②流式细胞术 经过上述处理将细胞悬浮在roS+2%FBS中，并用PE-Cy7缀合的F4/80(BioLegend，SanDiego，CA)和FITC缀合的⑶45(BioLegend)染色，然后进行流式细胞术分析（BDFACSCalibur，加利福尼亚州圣何塞）。FlowJoX用于分析结果。 5)RT-qPCR 将患者或小鼠的伤口或以及正常组织通过超声组织研磨装置（F6/10，Jingxin，Shanghai，China)在PBS中匀浆。然后，根据RT-qPCR试剂盒说明书，使用RNA提取试剂盒（Invitrogen，Waltham，MA)从组织中分离出总RNA。进行逆转录之后进行PCR扩增。α-1I型胶原蛋白（Col1)、转化生长因子β-1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA)、IL1b、IL6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C-C基序的引物趋化因子配体2(Ccl2)和0-肌动蛋白的引物由Genescript(中国，南京)公司合成。用溶体曲线分析其准确性。用2_ΔΔCt值计算基因表达量。β-肌动蛋白作为靶基因归一化的内控因子。 б)酶联免疫吸附试验（ELISAs) 根据制造商(Ramp;D,Minneapolis,MN)的待测因子的ELISAs试剂盒说明书，测定炎症细胞因子（包括TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2和CGRP)的表达水平。 7)蛋白质印迹测定（WB，WesternBlot) 将患者或小鼠的伤口以及正常组织通过组织研磨装置（F6/10，Jingxin，Shanghai，China)在RIPA蛋白裂解液中均质化。将等量的蛋白质样品加载到SDS-PAGE凝胶中，然后将蛋白质转移到PVDF膜中。将膜在5%脱脂奶粉配置溶液中封闭后，加入一抗并放置于4℃冰箱中孵育过夜。GAPDH用作内部对照。第二日洗膜后，加入适当的二抗并在室温下孵育1小时。应用成像系统(AmershamImage600,GE,LittleChalfont,Buckinghamshire,UnitedKingdom)来鉴定蛋白质的表达。 8)统计分析 应用GraphpadPrism7进行统计分析。进行t检验、单因素或双向AN0VA和事后检验。数据表示为平均值土SEM。p值＜0.05定义为两组间有统计学意义。 研究结果： 第一部分：在人增生性瘢痕和小鼠皮肤瘢痕中观察到CGRP水平升高 1.1我们首先使用ELISA和Western免疫印迹测定了正常皮肤组织和增生性瘢痕组织中CGRP蛋白的表达情况。ELISA测定结果显示，与正常组织相比，人增生性瘢痕组织中和小鼠皮肤瘢痕中CGRP蛋白水平显着增加（p＜0.01)。同样，Westernblot结果也证实，在人增生性瘢痕组织中和小鼠皮肤瘢痕中CGRP蛋白水平的表达较正常皮肤组织相比，显著增加（p＜0.01)。 1.2我们还进一步探讨了小鼠伤口愈合中期（d5)和终末期（d10)小鼠皮肤瘢痕中CGRP的表达情况。前面ELISA和Western印迹均显示，皮肤切除小鼠模型中，小鼠皮肤瘢痕中CGRP的蛋白质水平与正常组织相比显著增加。并且，小鼠皮肤瘢痕组织中，第10天较第5天相比，CGRP蛋白水平显著升高（p＜0.01)。 第二部分:外源性CGRP影响瘢痕形成和炎症相关基因的表达以及影响巨噬细胞的浸润 2.1探讨外源性CGRP对小鼠皮肤切除模型中瘢痕形成的影响，将小鼠分为外源性CGRP注射组，CGRP拮抗剂注射组和PBS对照组。应用数显卡尺测量三组伤口的面积，结果显示三组之间伤口面积没有差异。 2.2我们进一步探究了瘢痕形成相关基因CoL1、TGF-β1和α-SMA表达的影响。研究结果显示与PBS对照组相比，CGRP处理组Col1、TGF-β1和α-SMAmRNA表达显著降低（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.05)。另外，我们还测定了这些基因的蛋白表达情况。同样，结果也证实，与PBS对照组相比，Col1、TGF-β1、a-SMA蛋白表达显著降低（p＜0.05,p＜0.05,p＜0.05)。 2.3与PBS对照组相比，CGRP(8-37)处理组Col1、TGF-β1和α-SMAmRNA表达显著增加（p＜0.01,p＜0.001,p＜0.01)。并且Col1、TGFβ1、α-SMA蛋白表达CGRP(8-37)处理组较PBS对照组明显升高（p＜0.05,p＜0.01,p＜0.001)。 2.4我们进一步探讨CGRP对炎症相关基因IL1b、IL6、TNF-α、Ccl2表达的影响。首先，我们先从mRNA水平探究CGRP对这些基因的影响，与PBS对照组相比，CGRP组的IL1b、IL6、TNF-α和Ccl2mRNA表达水平显著降低(p＜0.05,p＜0.01,p＜0.01)。然而，CGRP(8-37)组的IL1b、IL6、TNF-α和Ccl2mRNA表达水平则显著升高(p＜0.001,p＜0.01,p＜0.01,p＜0.001)。同样，Westernblot结果也显示，与PBS对照组相比，CGRP组IL6、TNF-α和Ccl2的蛋白表达水平显著下降(p＜0.05,p＜0.05,p＜0.05)而CGRP(8-37)组IL6、TNF-a和Ccl2的蛋白表达水平则显著升高(p＜0.05,p＜0.01,p＜0.01)。 2.5然后，我们使用流式细胞计数分析瘢痕组织中⑶45+F4/80+巨噬细胞的数量。有趣的是，我们观察到CGRP组⑶45+F4/80+巨噬细胞的频率明显降低（p＜0.05)，amp;nbsp;而CGRP(8-37)组⑶45+F4/80+巨噬细胞的频率明显增加(p＜0.05)。 第三部分：CGRP抑制BMDMs细胞中炎性细胞因子的表达 3.1我们探讨了外源CGRP对BMDMs中炎症基因的表达情况，以证实CGRP对BMDMs细胞炎症相关基因表达的调控。应用LPS诱导BMDMs细胞，观察炎症因子表达情况，实验结果显示：与PBS对照组相比，外源性CGRP抑制了炎症基因（包括IL1b、IL6、TNF-α、和Ccl2)的mRNA表达（p＜0.01，p＜0.01，p＜0.05和p＜0.05)，然而，在没有LPS刺激的下，PBS对照组和CGRP处理组之间在上述的炎症基因的表达上没有明显的差异。 3.2本研究进一步探讨了CGRP调节BMDMs细胞中炎症反应的潜在机制。结果显示：与PBS对照组相比，CGRP组显著抑制了LPS诱导的BMDMs中核因子kB抑制剂（iKBα)的磷酸化(p＜0.01)。此外，我们还观察到，CGRP组显著抑制了LPS诱导的BMDMs中ERK的磷酸化(p＜0.05)。然而，BMDMs细胞在没有LPS诱导的情况下，CGRP组iKBa和ERK的磷酸化水平并没有显著的变化，说明CGRP仅仅在有炎症反应的状态中起到了一定的调节作用。综上所述，CGRP在炎症刺激的情况下，通过抑制NF-κB和ERK信号通路调控炎症基因表达。 研究结论： 本课题论证了人增生性瘢痕及小鼠全层皮肤切除创面模型中CGRP的表达水平较正常组织相比显著增加。体内研究证实通过调节CGRP的表达水平，皮肤切除小鼠模型中瘢痕形成相关基因（Col1、TGF-P1和a-SMA)，炎症相关基因（IL1b、IL6、TNF-α、Ccl2)的表达均受到调控，同样也调控了⑶45+F4/80+巨噬细胞在瘢痕组织的浸润。在体外研究中，我们观察到外源性CGRP通过调控LPS抑制的BMDMs中的NF-kB和ERK信号通路，调控了增生性瘢痕的形成。
NETL