摘要
本文从以下三部分进行阐述： 第一部分 目的： 明确GRIM-19在人类成熟精子中的定位及mRNA和蛋白的表达差异，探究GRIM-19与弱精子症发生的拟合曲线关系。 方法： 1.标本收集:弱精子症标本来自于郑州大学第一附属医院生殖中心门诊2020年10月～2021年6月期间就诊的患者，正常对照标本是同时期各项精液检查合格的患者标本。两组受试者均禁欲3～7天，手淫法收集精液至无菌杯中，37℃孵育，60min内液化完全，两组各纳入40例标本。弱精子症的诊断标准根据世界卫生组织(World health organization，WHO)第五版精液分析的指南制定。 2.分别用免疫荧光法(immunofluorescence method，IF)、定量逆转录聚合酶链反应(reberse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR)与蛋白印迹法(western blotting，WB)检测两组精子细胞中GRIM-19的分布及mRNA和蛋白水平的表达，并建立平滑拟合曲线进一步探讨GRIM-19与弱精子症发生的关联性。 结果： 1.免疫荧光结果显示，GRIM-19在弱精子和正常精子中均有表达，主要表达于精子的头部和线粒体所在的中部位置，弱精子症组精子中GRIM-19的荧光表达量低于正常对照组。 2.RT-qPCR定量分析结果显示，与正常对照组比较，弱精子症组精子中GRIM-19的mRNA表达明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.001)，拟合曲线进一步明确GRIM-19的mRNA表达水平与弱精子症的发生存在负相关性，差异有统计学意义(OR=0.266; 95％ CI=0.081～0.868; P=0.028)。 结论： 1.GRIM-19主要表达于精子的头部和线粒体所在的中部位置，弱精子症组患者精子中GRIM-19的mRNA和蛋白表达均明显低于正常对照组，平滑拟合曲线进一步明确了两者之间存在负相关性。 2.GRIM-19与弱精子症的发生密切相关，其可能参与了精子的能量代谢和增殖凋亡、迁移的过程。 第二部分 目的： 探讨GRIM-19在GC-2 spd小鼠精母细胞系中对细胞增殖、凋亡和运动迁移能力的调控作用，分析GRIM-19在弱精子症发病中可能的调控机制。 方法： 1.GC-2 spd小鼠精母细胞系来源自美国ATCC培养细胞库(Manassas，Virginia，USA)。分别对GC-2 spd细胞系进行过表达和沉默GRIM-19操作，构建相应表达的细胞系模型，并对构建完成的细胞系模型中GRIM-19的表达情况采用RT-qPCR与Western blotting验证。 2. 通过MTT实验，分别对过表达GRIM-19、沉默GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞系进行细胞增殖情况检测。 3.通过流式细胞学实验，分别对过表达GRIM-19、沉默GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞系进行细胞凋亡情况检测。 4.通过细胞划痕实验，分别对过表达GRIM-19、沉默GRIM-19的GC-2 spd精母细胞系进行运动迁移能力检测。 结果： 1.Western blotting定量分析结果显示，与对照组比较，GRIM-19在过表达GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞系中的蛋白表达量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与对照组比较，GRIM-19在沉默GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞系中的蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.001)。 2.RT-qPCR结果显示，与对照组比较，GRIM-19在过表达GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞系中的mRNA表达量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。与对照组相比，GRIM-19在沉默GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞系中的mRNA表达量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.001)。 结论: 1.成功构建了过表达GRIM-19、沉默GRIM-19的GC-2spd小鼠精母细胞系模型。 2.过表达GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞的增殖和运动迁移能力增加，而细胞凋亡率减少。 3.沉默GRIM-19的GC-2 spd小鼠精母细胞的增殖和运动迁移能力减低，而细胞凋亡率增加。 4.GRIM-19通过促进GC-2 spd精母细胞的增殖和运动迁移，抑制GC-2 spd细胞的凋亡，继而参与了弱精子症疾病发生过程中可能的作用机制。 第三部分 目的: 探讨GRIM-19在GC-2 spd小鼠精母细胞中调控p-ERK1/2蛋白的表达，分析ERK1/2信号通路在GC-2 spd细胞系中对细胞增殖、凋亡和运动迁移的调控作用，并研究GRIM-19通过ERK1/2信号通路调控下游与弱精子症发生相关的基因表达变化，进而探究GRIM-19在弱精子症发生过程中可能的作用机制。 方法: 1. 利用Western blotting定量分析验证过表达与沉默GRIM-19的GC-2spd小鼠精母细胞系细胞中的p-ERK1/2蛋白表达水平。 2. 构建沉默p-ERK1/2、沉默GRIM-19、沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2的GC-2spd小鼠精母细胞系模型，并在各细胞系模型中对GRIM-19、p-ERK1/2的表达情况进行Western blotting实验验证。 3. 通过MTT法，对沉默p-ERK1/2、沉默GRIM-19、沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2的GC-2 spd精母细胞系进行细胞增殖能力检测。 4. 通过流式细胞仪，对沉默p-ERK1/2、沉默GRIM-19、沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2的GC-2 spd精母细胞系进行细胞凋亡情况检测。 5. 通过细胞划痕实验，对沉默p-ERK1/2、沉默GRIM-19、沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2的GC-2 spd精母细胞系进行细胞运动迁移能力检测。 6. 利用Western blotting实验检测沉默p-ERK1/2、沉默GRIM-19、沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2的GC-2 spd精母细胞系中与弱精子症发生关系密切的HIF-1α、c-Caspase 3和COX-2蛋白的表达情况。 结果: 1. 与对照组比较，GRIM-19在过表达GRIM-19的GC-2 spd精母细胞系中的蛋白表达量明显升高(P＜0.001)，同时p-ERK1/2的蛋白表达量明显降低(P＜0.01)。与对照组比较，GRIM-19在沉默GRIM-19的GC-2 spd精母细胞系中的蛋白表达量明显降低(P＜0.01)，同时p-ERK1/2的蛋白表达量明显增高(P＜0.01)。 2. Western blotting实验结果显示，与对照组比较，沉默p-ERK1/2的GC-2 spd精母细胞系中p-ERK1/2的蛋白表达量明显降低(P＜0.001)，沉默GRIM-19的GC-2 spd精母细胞系中p-ERK1/2的蛋白表达量明显升高(P＜0.01)。与沉默GRIM-19细胞系比较，p-ERK1/2在沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2细胞系中的蛋白表达量明显降低(P＜0.001)。 3.与对照组比较，沉默GRIM-19可使GC-2 spd精母细胞增殖能力明显减低(P＜0.05)，沉默p-ERK1/2可使GC-2 spd精母细胞增殖能力明显增加(P＜0.05)，而在沉默GRIM-19的GC-2 spd精母细胞系中进一步沉默p-ERK1/2的表达，与单独沉默GRIM-19的GC-2 spd组比较，增殖能力明显增加(P＜0.05)。 结论: 1.在GC-2 spd精母细胞中，GRIM-19可以调控ERK1/2磷酸化水平的表达。 2.成功构建了沉默p-ERK1/2、沉默GRIM-19和沉默GRIM-19且沉默p-ERK1/2的GC-2 spd细胞系模型。 3.沉默p-ERK1/2可使GC-2spd细胞增殖和运动迁移能力增加，细胞凋亡减少。 4.在沉默GRIM-19的GC-2spd细胞系中进一步沉默p-ERK1/2的表达可阻止沉默GRIM-19引起的GC-2spd细胞增殖和运动迁移能力减低，细胞凋亡增加。 5.GRIM-19可以通过ERK1/2信号通路抑制GC-2spd精母细胞中HIF-1α、c-Caspase 3与COX-2的蛋白表达，继而参与了弱精子症疾病发生和发展过程中可能的作用机制。
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