摘要
结肠炎和结肠炎相关性结肠癌(colitis-associated colon cancer，CAC)都属于严重威胁人类健康的系统性胃肠道疾病，通常是由肠道微生物群、黏膜屏障、环境、免疫系统等多重复杂因素相互作用的结果，其预防和治疗均面临着巨大的挑战。近年来，益生菌、宿主以及肠道微生物群之间的相互作用关系逐渐明晰。通过口服益生菌正向调节肠道微生物群、增强肠道黏膜屏障、竞争性抑制或清除致病菌等治疗手段获得了众多研究学者的认可。然而，大多数益生菌口服后难以耐受恶劣的胃酸环境，致使运送至肠道的有效活菌数量得不到保障。值得注意的是，芽孢(spore)作为益生菌的休眠体，被一层抗逆性较强的疏水性蛋白外壳包裹，口服后能够在复杂多变的胃肠道环境中保持良好的生理活性，为制备治疗性纳米药物和益生菌制剂提供一个理想平台，有望成为结肠炎及CAC防治的突破口。本文以有效增强纳米粒在胃肠道中的稳定性、提高口服药物生物利用度和益生菌定植效率为出发点，基于益生菌芽孢构建不同类型的口服递送系统，并分别在体外和体内开展了系列基础研究。具体如下: 1. 基于益生菌芽孢的口服自组装纳米药物用于结肠癌治疗研究 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，BC)在营养物质匮乏的环境中能够产生芽孢。口服后，芽孢可顺利通过胃酸环境并被递送至肠道，与肠道微环境中的某些营养物质结合后，其疏水性蛋白外壳脱落，从而触发萌发过程，重新生成营养细胞并定植在肠道。 基于上述BC芽孢的天然特性，本研究在芽孢表面修饰脱氧胆酸(deoxycholic acid，DA)并装载抗肿瘤药物盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)和索拉菲尼(sorafenib，SOR)，构建一种口服后能够在肠道内通过自主萌发而形成治疗性载药纳米粒（nanoparticles，NPs）的“生成器”（DOX/SOR/Spore-DA）。实验结果表明，对芽孢进行修饰和载药，几乎不会影响其生物活性，这是芽孢在小肠中萌发脱落的芽孢壳蛋白与DA和药物自组装形成载药NPs的关键条件。DOX/SOR/Spore-DA中DOX和SOR的载药量分别约为11.5％和25.7％,能够满足形成治疗性NPs。模拟胃肠道环境的萌发实验结果表明，小肠是芽孢萌发最适宜的区域。Spore和DOX/SOR/Spore-DA在生长培养基中孵育后的透射电镜结果显示，DOX/SOR/Spore-DA通过萌发自组装形成粒径均一、分散均匀的DOX/SOR/Spore-DA NPs，而单独的spore孵育6h后未形成NPs。随后，Caco-2细胞摄取和跨上皮转运实验结果表明，DOX/SOR/Spore-DA NPs通过顶端钠离子依赖性胆酸转运体（apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT）介导的内吞途径被细胞摄取，经过溶酶体逃逸后，增强其跨上皮转运效率，进而使得基底侧的药物含量相较于DOX/SOR组提高约2.2倍。体外抗肿瘤细胞实验结果显示，DOX/SOR/Spore-DA NPs组的细胞存活率仅为42.4％，显著低于其他组，表明其具有较好的体外抗肿瘤活性。体内肠组织摄取、活体小肠绒毛吸收以及在体肠循环结果均表明，DOX/SOR/Spore-DA在体内能够自主生成DOX/SOR/Spore-DA NPs，并通过增强上皮细胞摄取转运效率提高药物的口服生物利用度。相对于口服DOX/SOR组，DOX/SOR/Spore-DA组的相对生物利用度提高约9.4倍。体内抗肿瘤活性研究中，相对于生理盐水组，DOX/SOR/Spore-DA组小鼠的肿瘤抑制率高达79.6％，具有显著的抗肿瘤效果。 2. 基于芽孢壳的口服益生菌递送系统的构建及其结肠炎和相关癌症治疗研究 肠道菌群失调和肠黏膜屏障破坏是结肠炎和CAC的主要病理特征。尽管口服益生菌制剂在治疗结肠炎和CAC方面具有显著优势，但益生菌的活性和定植效率仍然受辅料和生产工艺等相关因素的影响。此外，芽孢作为口服递送益生菌的一种形式，也存在体内萌发效率不能被准确控制这一固有局限性。因此，如何通过简单有效的策略充分利用高抗逆性的芽孢壳，增强益生菌的口服递送及其肠道定植效率是提高益生菌制剂对结肠炎和CAC治疗效果的关键所在。 基于此，本研究以BC为模型菌株，创新性地将其芽孢壳分离制备成一种多功能芽孢壳纳米材料（coat nanomaterial，CN），并作为保护性“盔甲”重新吸附在BC表面制备得到CN@BC。然后分别通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，BS)和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，BL）验证该方法的通用性。体外结果表明，CN保留了芽孢壳成分的完整性，且具有较高的胃肠环境稳定性。此外，CN还具有抑制由H2O2诱导的细胞氧化损伤、修复肠上皮黏膜屏障、为益生菌的快速增殖提供额外的营养物质以及促进益生菌与有害菌的竞争性定植和增殖等特点。最后，分别通过健康小鼠模型、葡聚糖硫酸纳(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的结肠炎小鼠模型和氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)与DSS联合诱导的CAC小鼠预防模型，对CN@BC的生物安全性、治疗和预防作用进行了系统评估。结果表明，口服48 h后，CN@BC能够抵抗胃酸环境，在健康小鼠结肠部位快速定植，并且几乎不会破坏肠黏膜屏障，诱发肠道炎症反应，具有较好的生物安全性。此外，CN@BC能够通过降低IL-1β、IL-6和TNF-α等典型促炎细胞因子的表达水平以及阻断与肿瘤发生密切相关的IL-6-STAT3通路，抑制炎症发展进程。CN@BC还能增加与恢复肠道黏膜屏障有关蛋白ZO-1和Occludin的表达水平，从而达到较好的结肠炎及CAC治疗效果。值得关注的是，16S rDNA菌群测序分析和Tax4fun功能注释聚类热图结果显示，CN@BC组可显著提高肠道中有益菌群的丰富度和多样性，降低与肿瘤发生发展相关物种的相对丰度。结果还显示，CN@BC组小鼠肠道微生物群的组成和功能与健康小鼠相似，表明CN@BC对CAC具有良好的治疗和预防作用。
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