摘要
生理性血管生成在眼睛发育过程中至关重要，对于形成正常视力是不可或缺的。相反，病理性的血管新生常好发于增生性糖尿病视网膜病变(PDR)和早产儿视网膜病变(ROP)等疾病，并且由于新生血管的高通透性，常导致视网膜出血、水肿、牵拉性脱离甚至视力完全丧失。 在IL-4等某些炎症因子刺激下，成熟的巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞。它可以通过促进VEGF的分泌加速血管内皮细胞生长，或促进细胞外基质中MMP-2和MMP-9的分泌促进血管内皮细胞增殖和迁移，进而诱导视网膜血管异常增生。有研究报道，减少M2型巨噬细胞可以有效减少眼底新生血管生成。 向眼底输送药物一般有两种方式，一种是玻璃体腔注射等侵入性治疗方式，另一种是局部点眼等非侵入性治疗方式。玻璃体腔注射因其局部作用针对性强且易于达到治疗浓度而常用于临床。然而，它有眼压升高、眼内炎症以及并发性白内障等潜在副作用和并发症。由于眼球本身的结构和生理特性，局部点眼后，停留在眼表的药物只有5％左右，可以到达眼底的药物更是微乎其微。结合上述问题，目前还缺乏一种无创、高效的给药方式，能够穿透眼表将药物缓释至眼后段。 因此，我们设计了一种可形貌转变的共组装糖肽纳米材料(MRP@DOX)作为药物递送系统，它可以有效地穿透角膜和巩膜屏障，然后在眼底微环境特异性靶向M2型巨噬细胞并长效释放药物，最终防止眼底新生血管形成。我们分别在溶液态、细胞和动物水平对其性质及作用机制进行了探讨。 第一部分 MRP@DOX的合成和组装性能研究 目的： 合成带正电的共组装糖肽纳米颗粒，探究不同组分间最佳比例。 方法： 1、通过多肽固相合成法合成阳离子肽RP(序列:RTTAANLVFF)，并通过Click反应合成糖肽MP(序列:Mannose-AANLVFF)。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和高效液相色谱法(HPLC)分别检测MP和RP的分子量和纯度。 2、芘荧光探针光谱法测定MP和RP的临界胶束浓度(CMC)，透射电子显微镜(TEM)以及动态光散射(DLS)分析MP和RP的组装行为。 结果： 1、MP和RP的CMC分别为3.4 μM and 18.5 μM。 2、MP组装成横截面直径为1.9±0.2 nm、zeta电位为+4.2 mV的纳米纤维，RP组装成直径为37.8±9.0 nm、zeta电位为+18.1 mV的纳米颗粒。 结论： 糖肽、阳离子肽和阿霉素可以1∶50∶50的摩尔质量比共组装成带正电的的纳米颗粒(MRP@DOX)，符合眼底药物递送所需条件。 第二部分 legumain对MRP@DOX的特异性酶切作用 目的： 在溶液态和细胞水平探讨legumain对MRP@DOX的特异性酶切作用，探究酶切作用位点以及酶切前后形貌变化。 方法： 1、将RP和legumain共孵育24 h，利用HPLC和MALDI-TOF-MS检测legumain的酶切作用位点。 2、将MRP@DOX里两条多肽中的AAN序列替换为AAA序列，设置为对照组(MAP@DOX)，实验组和对照组分别与legumain共孵育24 h，取不同时间点用TEM和DLS观察溶液态纳米材料的形貌动态变化过程。 结果： 1、RP的出峰时间为11.6 min，分子量为1139.7，和legumain共孵育后，出现了2.9 min和12.8 min处的新峰以及547.3和633.3的新分子量，推测legumain可以识别AAN序列，水解天冬酰胺(N)羧基端的酰胺键，生成序列为LVFF的新产物。 2、TEM和DLS结果显示，实验组MRP@DOX纳米颗粒在legumain的酶切作用下，LVFF序列重新组装成纳米纤维的形态;对照组MAP@DOX则维持纳米颗粒的形态。 结论： Legumain可以识别AAN序列，水解天冬酰胺(N)羧基端的酰胺键，使MRP@DOX从纳米颗粒的形态转变为纳米纤维。 第三部分 探究MRP@DOX在细胞中的作用过程以及滞留机制 目的： 探讨MRP@DOX对M2型巨噬细胞的特异性靶向作用，入胞后和legumain的作用过程以及在细胞内长效滞留的机制。 方法： 1、将M2型巨噬细胞或HUVECs分别和MRP@DOX共孵育1h，利用扫描电镜(SEM)观察细胞表面。 2、将M2型巨噬细胞和MRP@DOX共孵育，分别取1h和4h时间点利用CLSM检测细胞内荧光分布，观察MRP@DOX在M2型巨噬细胞内随时间变化的分布情况。 3、通过不断换液模拟细胞代谢环境，取24 h内不同时间点观察实验组MRP@DOX和对照组MAP@DOX在M2型巨噬细胞内的滞留时间和实时滞留量;取6h时计算释放DOX的入核量，并探究纳米纤维的滞留机制。 结果： 1、SEM结果显示，和MRP@DOX共孵育后，原本光滑的M2型巨噬细胞表面附着大量的纳米颗粒，而和HUVECs共孵育后，细胞表面依然光滑，没有明显纳米颗粒附着现象。 2、1h时，MRP@DOX主要聚集在溶酶体内，MRP@DOX和溶酶体共定位系数为0.97，4h时，MRP@DOX均匀分布在细胞内，MRP@DOX和溶酶体共定位系数为0.72。推测MRP@DOX通过细胞表面配受体结合后介导内吞作用，首先进入细胞溶酶体内，然后在legumain的酶切作用下形成纳米纤维后从溶酶体中逃逸出来并释放DOX进入细胞核。 3、和MAP@DOX对照组相比，MRP@DOX在细胞内滞留时间更长，DOX入核量更多。在对照组细胞周围发现了大量被排出的纳米颗粒，而MRP@DOX组细胞周围未发现明显纳米颗粒存在，由此推测纳米纤维可通过抑制细胞胞吐作用实现细胞内长时间滞留。 4、MRP对M2型巨噬细胞和HUVECs均没有细胞毒性，DOX对M2型巨噬细胞和HUVECs均具有杀伤作用，包载DOX后的MRP@DOX对M2型巨噬细胞显示出剂量依赖性杀伤作用，而对HUVECs没有明显细胞毒性，证明MRP@DOX降低了DOX对除M2型巨噬细胞外的细胞毒性，并且对M2型巨噬细胞的杀伤效果优于维持纳米颗粒形态的MAP@DOX对照组。 5、M2型巨噬细胞可以促进内皮细胞增殖和迁移，MRP@DOX、MAP@DOX和M2型巨噬细胞共孵育后均可以抑制该现象，MRP@DOX组效果优于MAP@DOX对照组。 结论： MRP@DOX可以精准靶向M2型巨噬细胞，入胞后在legumain酶切作用下通过形貌转变实现溶酶体逃逸，成功释放DOX入核;纳米纤维通过抑制细胞胞吐作用长时间滞留在细胞内;MRP@DOX选择性杀伤M2型巨噬细胞，并抑制M2型巨噬细胞引起的内皮细胞增殖。 第四部分 MRP@DOX在小鼠OIR模型中减少视网膜新生血管的效果评估 目的： 探讨MRP@DOX在小鼠眼球的入眼途径，检测MRP@DOX在小鼠OIR模型中减少视网膜新生血管的作用，评价MRP@DOX对眼部组织及心脏的生物相容性。 方法： 1、用MRP@DOX溶液对小鼠局部点眼，做全眼冰冻切片观察眼组织内荧光分布，分析MRP@DOX的入眼途径。 2、建立小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)模型，将出生7天的小鼠放入高氧环境中，在第12天恢复正常氧环境后用MRP@DOX溶液对小鼠点眼，每日一次，直至第17天处死全部小鼠。做视网膜铺片，CLSM观察视网膜中央无灌注区面积并计算视网膜外周单位面积内新生血管分支数。视网膜组织石蜡切片HE染色后计算单位面积突破视网膜内界膜的细胞核数量，免疫组织化学染色观察血管内皮生长因子(VEGF)表达并计算单位面积光密度。 3、使用DOX或MRP@DOX对小鼠点眼28天，观察角膜形态并做组织切片检测角膜厚度，分析MRP@DOX对眼部组织的安全性;利用血常规检测白细胞和血小板水平、血生化检测肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平、心脏组织切片观察心肌状态，分析MRP@DOX对心脏组织的安全性。 结果： 1、MRP@DOX在角膜和视网膜各层均有分布。 2、在小鼠OIR模型中，MRP@DOX可以减小视网膜中央无灌注区面积，减少单位面积内视网膜外周新生血管分支数，减少单位面积突破视网膜内界膜的细胞核数量，降低VEGF表达，效果优于MAP@DOX对照组。 3、单纯DOX溶液局部点眼后，小鼠出现了角膜水肿、增厚以及基质层胶原纤维紊乱的现象，而MRP@DOX点眼后眼部组织正常，证明MRP@DOX可以防止DOX引起的角膜水肿及炎症反应，减少DOX对眼部组织的细胞毒性;白细胞、血小板、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平均正常，心脏组织切片正常，证明MRP@DOX可防止DOX引起的的心毒性。 结论： MRP@DOX通过角膜途径和巩膜途径共同作用到达视网膜;小鼠OIR模型中，MRP@DOX可以通过减少VEGF表达减少视网膜新生血管;MRP@DOX具有良好的生物相容性。
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