摘要
恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，全球范围内，肿瘤的发病率和死亡率均在不断攀升。近年来，临床上传统的肿瘤治疗手段并未取得突破性进展，但是以免疫检查点阻断和嵌合抗原受体T细胞治疗等为首的免疫治疗手段在改善血液瘤患者预后、延长其生存时间方面取得了突破性的进展。然而，由于实体瘤中肿瘤微环境的存在，限制了肺癌、肝癌等实体瘤患者在免疫治疗中的受益。骨髓来源抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是构成肿瘤微环境和导致实体瘤免疫治疗效果不佳的主要成分之一，靶向MDSCs是改善肿瘤微环境，提高实体瘤患者免疫治疗效果的重要突破点。萝卜硫素(Sulforaphane，SFN)是一种常见的植物化学物，主要存在于西兰花等十字花科蔬菜中，在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用。既往研究表明，SFN通过抑制巨噬细胞移动抑制因子的表达，促进MDSCs的成熟和分化，降低MDSCs的比例和免疫活性，但相关机制仍不清楚。 因此，本课题通过细胞模型、动物模型和临床试验，多层次验证SFN对MDSCs的作用及SFN调控MDSCs比例和功能的分子机制，为SFN在肿瘤患者的临床应用提供思路和证据。 研究目的： 1.建立小鼠肺癌(lewis lung cancer cell lines，LLC)和小鼠黑色素(B16)移植瘤模型，给予SFN/DMSO干预，探讨SFN对荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响; 2.明确SFN降低MDSCs的途径，结合RNA-seq测序结果，探讨IL12RB2介导的SFN诱导MDSCs凋亡及相关机制;并探讨SFN对MDSCs免疫抑制功能及糖代谢水平的影响; 3.病例对照研究探讨MDSCs和T细胞在肿瘤患者外周血中的分布特征，临床试验探讨SFN干预对非肿瘤患者MDSCs比例和T细胞功能的影响。 研究方法： 1.萝卜硫素对荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响 通过构建LLC和B16的皮下移植瘤模型，在荷瘤9天后，腹腔注射SFN(50mg/kg/d) /DMSO，干预12天后处死小鼠，采用流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏和肿瘤组织中免疫细胞亚群的比例; 2.萝卜硫素促进骨髓来源细胞凋亡的机制研究 (1)通过磁分选获取荷瘤小鼠肿瘤组织中的MDSCs并进行RNA-seq测序，寻找SFN影响MDSCs的关键分子及机制; (2)采用鼠源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)+粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimul ating factor，G-CSF)重组蛋白体外诱导小鼠骨髓细胞72h，通过流式细胞术和Western blot等方法检测MDSCs比例和凋亡;通过PCR等实验技术检测FasL、MMP3、IL 12RB2等分子的表达; (3)利用IL 12RB2中和抗体，体内外验证IL12RB2在SFN诱导MDSCs凋亡中的作用。 3.萝卜硫素对骨髓来源抑制细胞免疫抑制功能的研究 (1)荧光定量PCR、Western blot、流式细胞术等检测MDSCs免疫抑制相关分子如PD-L1、Arg-1、iNOS2等的表达和活性，采用流式细胞术检测MDSCs对T细胞增殖和杀伤能力的影响; (2)海马能量实验检测SFN对MDSCs糖酵解和氧化磷酸化的影响; (3) GEPIA分析肺癌患者中MDSCs免疫抑制功能与糖代谢水平的相关性。 4.萝卜硫素对非肿瘤患者MDSCs影响的临床试验研究 通过病例对照研究，流式细胞术检测健康人和肿瘤患者外周血中MDSCs和T细胞比例;通过临床试验，给予纳入的非肿瘤患者补充SFN（200mg/d，干预30天），流式细胞术检测干预前后非肿瘤患者外周血中T细胞和MDSCs的变化。 研究结果: 1.萝卜硫素对荷瘤小鼠肿瘤微环境的影响 (1) SFN干预延缓了LLC和B16移植瘤的生长，且SFN对LLC (NOD/SCID，非肥胖联合重度免疫缺陷小鼠，non-obese diabetic/severe combined immune deficiency)生长的抑制作用较LLC (C57BL/6J)弱; (2) SFN干预降低荷瘤小鼠脾脏和肿瘤组织中MDSCs的比例，促进CD8+T细胞向肿瘤部位的浸润，P＜0.05。 (3)肿瘤中MDSCs的比例与肿瘤重量呈正相关(r=0.852，P＜0.001)，与肿瘤浸润的CD8+T细胞的比例呈负相关（r=-0.560，P=0.024）。 2.萝卜硫素促进骨髓来源细胞凋亡的机制研究 (1)荷瘤小鼠骨髓中MDSCs的比例在两组无差异(P＞0.05);而外周血、脾脏和肿瘤中MDSCs比例在SFN组显著降低;SFN增加MDSCs凋亡的比例和Cleaved-caspase3的表达，且在体外实验中也得到了相似的结果(P＜0.05); (2) RNA-seq测序结果提示IL12RB2是SFN诱导MDSCs凋亡的关键分子，SFN干预能上调MDSCs上IL12RB2的表达，并通过调控IL12RB2下游MMP3（下调）和FasL（上调）的表达，激活Cleaved-caspase3，诱导MDSCs凋亡; (3) SFN干预可以促进CD8+T细胞向肿瘤部位的浸润，增加CD8+T上IL-2、IFN-γ和Ki-67等的表达，增强CD8+T细胞的杀伤功能和增殖能力，中和IL12RB2可以部分逆转SFN诱导的MDSCs凋亡，促进MDSCs在荷瘤小鼠体内的蓄积，逆转SFN对荷瘤小鼠体内CD8+T的作用，P＜0.05。 3.萝卜硫素对骨髓来源抑制细胞免疫抑制功能的研究 (1) SFN干预降低了MDSCs上Arg-1、iNOS2等免疫抑制分子的活性和表达水平，削弱MDSCs对T细胞增殖能力和杀伤功能的抑制作用; (2) SFN降低了MDSCs的氧化磷酸化水平和糖酵解水平; (3) MDSCs的免疫抑制功能与糖酵解和氧化磷酸化水平呈显著正相关。 4.萝卜硫素对非肿瘤患者MDSCs影响的临床试验研究 (1)与健康人相比，肿瘤患者外周血中T细胞的比例降低，MDSCs的比例增加，外周血中MDSCs的比例与CD8+T细胞的比例呈正相关，r=0.38，P＜0.05; (2)肿瘤患者MDSCs上FasL和IL12RB2的表达水平较健康人低，IL12RB2、FasL的表达水平与MDSCs的比例呈负相关; (3) SFN干预可以降低非肿瘤患者外周血中MDSCs的比例，促进非肿瘤患者MDSCs上IL12RB2和FasL的表达; (4) SFN干预促进GITR+CD8+T细胞的比例，促进CD8+T的活化，而不影响CD8+T细胞的比例。 研究结论： 1.SFN能够降低荷瘤小鼠体内MDSCs的比例，促进CD8+T细胞的浸润，延缓肿瘤进展; 2.SFN不影响MDSCs的生成和趋化，但是具有诱导MDSCs凋亡，降低MDSCs的比例的作用。IL12RB2是SFN诱导MDSCs凋亡的关键分子，中和IL12RB2可以逆转SFN对MDSCs的促凋亡作用; 3.SFN通过重塑MDSCs的糖代谢，降低MDSCs的免疫抑制功能; 4.SFN干预能够降低非肿瘤患者外周血中MDSCs的比例，促进CD8+T细胞的活化。
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