摘要
高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）是嘌呤代谢紊乱导致血清尿酸水平过高而引起的一种代谢性疾病。随着生活水平的提高和生活方式的改变，HUA 患病人群日益增多，HUA 会诱发痛风、Ⅱ型糖尿病、高血压、冠心病等多种疾病，严重危害人们身体健康。目前，治疗HUA的药物具有诸多副作用，寻找效果显著、副作用小的天然成分为研究热点。近年研究表明，食源性活性肽不仅降尿酸效果显著，且有高营养、易吸收、副作用小等优点，受到人们广泛关注。远东拟沙丁鱼是南海盛产的低值海洋鱼，目前主要用于生产罐头，未制成高附加值产品，远东拟沙丁鱼蛋白质含量较一般鱼类高，富含芳香族和疏水氨基酸，是制备降尿酸肽的优质原料。本论文以远东拟沙丁鱼为原料，以黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）抑制率和低聚肽得率为指标，通过单因素试验和响应面优化试验制备酶解液，再通过超滤得到远东拟沙丁鱼小分子肽，以高尿酸血症小鼠为模型，研究远东拟沙丁鱼小分子肽的体内降尿酸活性和降尿酸机制。然后通过凝胶色谱分离和反相高效液相色谱分离纯化降尿酸肽，最后以高尿酸细胞为模型，鉴定降尿酸肽的体外降尿酸效果，主要研究内容和结果如下： 1、以XOD抑制率和低聚肽含量为指标，通过单因素试验分别改变酶解时间、pH、温度、料液比，研究出最优自溶条件，结果显示，单因素试验最优条件：pH8、温度55℃、时间5 h、料液比1:2。在此基础上选择适宜的外源酶，改变酶解时间、加酶量，再采用响应面优化试验得出最优酶解条件：pH9、时间4 h、温度60℃、料液比1:2、加酶量0.15%（酶干重/鱼肉），在此条件下，XOD抑制率为82.39%，低聚肽含量为85.34%。 2、采用截留分子量为10k Da、5k Da、1k Da超滤分离系统对远东拟沙丁鱼酶解液进行分离，并测定4个组分的XOD抑制率，结果显示，分子量小于1k Da的组分（小分子肽）XOD抑制率最高，其IC50为15.89 mg/mL。以高尿酸血症小鼠为模型，对远东拟沙丁鱼小分子肽进行降尿酸功效评价，结果表明，高尿酸血症小鼠补充远东拟沙丁鱼小分子肽后，血清尿酸水平显著降低，肌酐、尿素氮水平也显著降低，对小鼠肾组织病理学检查发现，补充远东拟沙丁鱼小分子肽的小鼠肾组织未见明显炎症细胞、肾小球基膜正常、肾小管上皮细胞未见脱落。 3、以高尿酸血症小鼠为模型，检测了小鼠肝脏XOD活力、肾脏中尿酸相关转运蛋白的mRNA表达水平和肾脏炎症因子表达水平，结果表明，小鼠肝脏XOD活力显著降低，减少了尿酸的合成，小鼠肾脏URAT1-mRNA、GLUT9-mRNA的表达水平降低、ABCG2-mRNA的表达水平升高，减少了尿酸重吸收和增加尿酸排泄，且小鼠肾脏中Casp-3、IL-1β 、NLRP3水平显著降低，减轻小鼠的肾脏炎症。 4、以远东拟沙丁鱼小分子肽为原料，采用 Sephadex G-15 凝胶色谱分离和反相高效液相色谱分离，从中分离纯化出2个新的XOD抑制肽，通过UPLC-MS/MS鉴定氨基酸序列为Phe-Leu-Arg，XOD抑制率的IC50值为0.499 mg/mL；Arg-Pro-Lys， XOD抑制率的IC50值为0.712 mg/mL。通过建立高尿酸细胞模型，研究小肽的降尿酸功效。结果表明，FLR、RPK均能显著降低细胞内尿酸水平，并且能显著降低细胞内Caspase-1、GSDMD、IL-1β、NLRP3等炎症因子的水平，具有改善炎症的效果。
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