摘要
本论文主要分为以下四个部分: 第一部分:宫颈癌组织中circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系; 第二部分:circ SMARCA5调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制; 第三部分:SND1调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制; 第四部分:circ SMARCA5对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤组织的生长作用。 第一部分 宫颈癌组织中circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系 目的： 1.检测宫颈癌鳞癌患者的癌组织和相应的癌旁组织中circ SMARCA5的表达水平; 2.明确circ SMARCA5的表达水平与患者预后的相关性。 方法： 1.收集2015年6月至2017年6月在郑州大学第二附属医院行手术治疗的50例宫颈癌患者（年龄44.52±10.73岁）的宫颈癌组织和邻近正常组织作为样本，所有患者均接受50个月的随访; 2.采用定量逆转录PCR技术（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）检测组织中circ SMARCA5的表达水平; 3.收集宫颈癌患者的临床病理资料，分析circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌临床病理参数的相关性; 4.通过SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0软件进行数据的统计和分析，所有数据以平均值±标准偏差（(x)±s）表示，数据行正态分布。两组之间的数据比较采用独立样本t检验，多组之间的比较使用方差分析。采用Kaplan Meier法和log-rank检验对宫颈癌患者进行生存分析。 结果： 1.宫颈癌患者癌组织中circ SMARCA5的表达水平和癌旁组织标本相比显著下调，差异具有统计学意义（P＜O.0001）; 2.低表达水平circ SMARCA5与FIGO分期、肿瘤细胞分化程度、肿瘤大小、间质浸润深度以及脉管间隙阳性显著相关; 3.Kaplan Meier分析结果显示，高水平circ SMARCA5组病人较低水平组生存期长，差异有统计学意义(P=0.040)。 结论： circ SMARCA5在宫颈癌组织中表达水平下调，其表达水平与宫颈癌的生长和转移以及患者的生存预后具有明显的相关性。 第二部分 circ SMARCA5调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制 目的： 1.探讨circ SMARCA5对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响; 2.明确circ SMARCA5与SND1之间的关系及调节机制; 3.探讨circ SMARCA5是否通过影响SND1的表达参与调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭。 方法： 1.采用RT-qPCR检测宫颈癌患者癌组织和癌旁组织标本以及人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7和癌细胞系（HeLa、HT-3、C33A和CaSki）中SND1的表达水平; 2.采用Pearson相关系数分析宫颈癌患者宫颈组织中circ SMARCA5和SND1表达水平的相关性; 3.过表达或敲低circ SMARCA5，通过细胞增殖与毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化; 4.通过甲基化位点的预测进一步分析circ SMARCA5调节SND1表达的机制，通过甲基化特异性PCR (Methylation-specific PCR，MSP)检测SND1的甲基化水平，采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunopreci-pitation，RIP)实验验证circ SMARCA5与DNMT3b的结合，通过染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验验证SND1启动子区域DNMT3b的富集; 5.过表达或敲低SND1，通过CCK-8、Annexin Ⅴ-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化; 6.共转染circ SMARCA5过表达载体和SND1过表达载体，通过CCK-8、Annexin Ⅴ-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化; 7.通过SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0软件进行数据的统计和分析，所有数据以平均值±标准偏差（(x)+s）表示，数据行正态分布。两组之间的数据比较采用独立样本t检验，多组之间的比较使用方差分析。 结果： 1.宫颈癌患者癌组织中SND1的表达水平和癌旁组织标本相比显著上调，差异具有统计学意义(P=0.0089); 2.Pearson相关系数分析显示circ SMARCA5的表达水平与SND1的表达水平呈负相关（r2=0.8031，P＜0.001）; 3.与正常宫颈细胞系相比，circ SMARCA5在宫颈癌细胞系中的表达水平显著下调(P=0.0027)，SND1表达水平显著上调(P＜0.0001)，差异均具有统计学意义; 4.过表达circ SMARCA5抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡; 5.SND1启动子区存在CpG岛，circ SMARCA5通过招募DNMT3b到SND1的启动子区域促进SND1的甲基化，下调SND1的表达; 6.过表达SND1促进宫颈癌细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡; 7.过表达SND1能消除circ SMARCA5抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡的能力。 结论： circ SMARCA5通过招募DNMT3b到SND1的启动子区域促进SND1的甲基化，下调SND1的表达，进而抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡。 第三部分 SND1调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制 目的： 1.探讨SND1与YWHAB之间的相互作用; 2.探讨circ SMARCA5是否通过调节SND1的表达影响SND1互作蛋白YWHAB，参与宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力的调节。 方法： 1.通过STRING在线数据库预测SND1的互作蛋白; 2.采用RT-qPCR检测宫颈癌患者癌组织和癌旁组织标本以及人正常宫颈细胞系和宫颈癌细胞系中YWHAB的表达水平; 3.采用Pearson相关系数分析宫颈癌患者宫颈组织中SND1和YWHAB表达水平的相关性; 4.过表达或敲低YWHAB，通过CCK-8、Annexin Ⅴ-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化; 结果： 1.宫颈癌患者癌组织中YWHAB的表达水平和癌旁组织标本相比显著上调，差异具有统计学意义（P=0.0037）; 2.Pearson相关系数分析显示SND1的表达水平与YWHAB的表达水平呈正相关(r2=0.8700，P＜0.001); 3.过表达YWHAB促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡; 结论： circ SMARCA5通过调节SND1的表达影响SND1互作蛋白YWHAB，参与宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的调节。 第四部分 circ SMARCA5对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长的作用 目的： 构建宫颈癌裸鼠移植瘤模型，通过体内实验进一步验证circ SMARCA5是否抑制宫颈癌的生长。 方法： 1.培养HeLa细胞，分别转染pLO-ciR-SMARCA5和空载体作对照; 2.建立宫颈癌异种移植小鼠模型:将18只小鼠随机分为3组，在裸鼠背侧近右后肢皮下接种未经转染的HeLa细胞（空白对照组），接种转染pLO-ciR空载体的HeLa细胞（pLO-ciR空载体对照组），接种转染pLO-ciR-SMARCA5质粒的HeLa细胞（pLO-ciR-SMARCA5组）; 3.注射后每周测量移植瘤的体积大小，持续28 d; 4.28d后，对小鼠实施安乐死，取出瘤体并测量肿瘤重量; 结果： 1.pLO-ciR-SMARCA5组肿瘤体积较pLO-ciR空载体对照组小，差异具有统计学意义(P =0.0015); 2.pLO-ciR-SMARCA5组肿瘤重量较pLO-ciR空载体对照组小，差异具有统计学意义(P =0.0002); 3.pLO-ciR-SMARCA5组与pLO-ciR空载体对照组相比，circ SMARCA5的表达水平升高(P =0.0002)，SND1 (P =0.0002)、YWHAB (P =0.0001)和抗凋亡蛋白（Bcl-2，P=0.0002; Survivin，P＜0.0001）的表达水平降低，差异均具有统计学意义。 结论： 在宫颈癌异种移植瘤小鼠模型中，circ SMARCA5明显抑制瘤体的形成和生长。
NETL