摘要
宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)为茄科(Solanaceae)枸杞属植物。宁夏枸杞果实是一种可鲜食又可干燥入药的植物组织材料，在我国已成为一种大众化的食品及保健品。酯化类胡萝卜素是宁夏枸杞果实呈现鲜红颜色的主要物质基础，也是枸杞发挥护眼保肝等功能疗效的重要活性物质。本研究通过表征连续变色群体果实类胡萝卜素代谢轮廓，分析盐胁迫下果实类胡萝卜素代谢谱，结合全基因组蛋白序列分析，筛选并鉴定宁夏枸杞玉米黄素酯化酶基因(zeaxanthin acyltransferase，ZATs)。主要研究成果如下: (1)表征变色群体果实类胡萝卜素代谢轮廓:在所构建的宁夏枸杞变色群体中，群体果实颜色从黄色到红色连续变异。通过对果实中10个类胡萝卜素成分进行定性定量分析，发现果实的差异着色主要是由于酯化类胡萝卜素差异累积所造成的。玉米黄素棕榈酸酯、隐黄质棕榈酸酯、花药黄质双棕榈酸酯、华菱草类胡萝卜素双棕榈酸酯、玉米黄素肉豆蔻酸棕榈酸酯和玉米黄素双棕榈酸酯含量少的果实呈现黄色，含量高的果实呈现鲜红色。通过qRT-PCR定量类胡萝卜素合成途径上相关基因的表达水平，分析基因表达水平与类胡萝卜素含量的相关关系，结果表明LbPSY(phytoene synthase)基因转录水平与酯化类胡萝卜素的含量密切相关。 (2)盐胁迫调控类胡萝卜素代谢分析:用300 mM NaCl灌溉宁夏枸杞植株，持续3个月后采收S1（绿果期）和S4（成熟期）两个发育时期的果实进行生化指标检测，代谢组及转录组分析。生化指标检测结果表明盐处理引起S1和S4果实的氧化胁迫。代谢组数据表明盐胁迫促使S4果实中大部分氨基酸、酚酸、黄酮、生物碱、脂质及类胡萝卜素含量增加;转录组数据则表明，脂质及脂肪酸相关代谢路径中大部分结构基因的表达，受盐胁迫诱导上调。通过整合代谢组及转录组数据发现盐胁迫通过上调类胡萝卜素合成结构基因LbPDS/LbZDS(phytoene desaturase/ζ-carotene desaturase)的转录，下调其降解结构基因LbAAO3(abscisic-aldehyde oxidase)和LbCYP707A的表达，从而增加成熟果实中酯化类胡萝卜素的含量。 (3)筛选并验证LbZAT功能:通过HMM search在宁夏枸杞基因组数据中检索到70条具有脂肪酰基转移酶结构域的蛋白序列。经亚细胞定位预测分析，其中有9条序列具有质体信号肽，命名为LbZAT1-9。LbZAT2的表达在S4果实中受盐胁迫调控;LbZAT1和LbZAT4在S2-S5果实中极显著高表达，在S3果实中达到了转录水平的峰值。通过拟南芥原生质体亚细胞定位实验发现，LbZAT1和LbZAT2以散点状定位于叶绿体。在宁夏枸杞愈伤中过表达LbZAT1和LbZAT2，获得比野生型颜色更黄的转基因愈伤组织。HPLC实验结果表明，LbZAT1和LbZAT2能促进愈伤组织中类胡萝卜素的酯化反应。而在透射电镜下观察到，LbZAT1和LbZAT2可以显著增加细胞质体数量，改变质体形态。OE-LbZAT1转基因愈伤组织的质体体积比对照组大、呈圆形，基质中充满淀粉粒;OE-LbZAT2质体呈现长条状，基质中类囊体叠层结构明显且伴有小液泡的产生。综上，LbZAT1和LbZAT2均定位于质体，具有促进愈伤组织酯化类胡萝卜素合成的功能，也能影响愈伤组织质体形态发育。 (4)在模式物种中验证LbZATs功能:烟草叶片中的类胡萝卜素成分主要是β-胡萝卜素。在烟草叶片中共过表达LbCHYB1/2和LbZAT1/2，可检测到玉米黄素双棕榈酸酯含量提高。在水稻中导入4个类胡萝卜素合成基因，ZmPSY、PaCrt、LbCHYB2和LbZAT1/2，可在F2种子中检测到玉米黄素的超量累积，未检测到酯化类胡萝卜素的合成。在玉米中过表达LbZAT1或LbZAT2，能促进籽粒酯化类胡萝卜素的合成。总体而言，LbZAT1和LbZAT2在作物中表现出促进类胡萝卜素酯化的作用，表明其具有用于创制新型功能营养种质的前景。 综上，本研究解析了宁夏枸杞类胡萝卜素在变色群体、盐处理条件下的差异累积机制;通过上述材料首次发掘并验证了宁夏枸杞类胡萝卜素酯化酶功能。该研究成果解析了宁夏枸杞类胡萝卜素合成代谢的关键节点基因，为宁夏枸杞果实发育的核心生物学问题提供理论依据，这将拓宽人们对植物类胡萝卜素合成与存储进化演变和分子调控机制新认知，并为酯化类胡萝卜素合成生物学及代谢工程研究提供必要且有效的分子元件。
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