摘要
目的：研究蒙药四味土木香散对机械牵张诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大模型的保护作用以及是否通过激活microRNA-34a-5p/Notch1通路对机械牵张诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大模型发挥保护作用。 方法：1. 四味土木香散含药血清的制备：40只Wistar大鼠分别灌胃等体积蒸馏水、0.972g/kg、1.944g/kg、3.888g/kg的四味土木香散水煎剂以及0.1g/kg阳性药卡托普利。每日1次，连续7d，末次给药后腹主动脉取血，离心备用。2. 细胞随机分为Control组和MS组，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western Blot）分别检测各组细胞ANP、BNP mRNA和蛋白的表达水平以验证机械牵张诱导的细胞肥大模型的造模效果。3. 细胞随机分为Control组、MS组、STP Low Dose组、STP Middle Dose组、STP High Dose组和Captopril组。不同剂量含药血清分别预干预培养10h和22h，20%水平牵张力牵张2h。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测各组细胞上清液的LDH活性，酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-6、TNF-α的含量变化，以筛选四味土木香散含药血清工作浓度与作用时间。4. 细胞随机分为Control组、MS组、MS+STP组和STP组。检测各组细胞miR-34a-5p的表达水平以及ANP、BNP mRNA和蛋白的表达水平。5. TargetScan 8.0数据库预测microRNA-34a-5p （miR-34a-5p）的靶基因结果显示Notch1具有高可信度。Notch1 3’UTR野生型（WT）和突变型（MUT）质粒分别与miR-34a-5p mimics和阴性对照（NC）共转染心肌细胞进行双荧光素酶报告基因分析检测，qRT-PCR和Western Blot验证Notch1 mRNA和蛋白的表达。6. 细胞随机分为Control组、MS组、MS+STP组、MS+STP+NC组和MS+STP+miR-34a-5p mimics组。Western Blot检测各组细胞ANP、BNP、Notch1、NICD1、Hes1的蛋白水平。7. 细胞随机分为Control组、MS组、MS+STP组、MS+STP+si-NC组和MS+STP+si-Notch1组。Western Blot检测各组细胞ANP、BNP的蛋白水平。 结果：1. MS组ANP、BNP的mRNA和蛋白表达水平较Control组显著升高（p＜0.01），提示体外机械牵张诱导的细胞肥大模型造模成功。2. 不同剂量含药血清干预细胞12h时LDH活性较MS组差异无统计学意义， STP Low Dose组干预24h时LDH活性较MS组显著降低（p＜0.05）；IL-6和TNF-α的含量随含药血清剂量的升高而降低（p＜0.01），故选择低剂量四味土木香散含药血清干预模型细胞24h作为最佳工作浓度与作用时间。3. MS组miR-34a-5p的表达较Control组显著上调（p＜0.01）；MS+STP组miR-34a-5p的表达较MS组显著下调（p＜0.01）。MS组ANP、BNP 蛋白表达水平较Control组显著升高（p＜0.01）；MS+STP组ANP、BNP 的蛋白表达水平较MS组显著降低（p＜0.05）。4. TargetScan 8.0预测显示Notch1基因3’端非翻译区（3’UTR）与miR-34a-5p有4个结合位点。Notch1 3’UTR-WT与miR-34a-5p mimics共转染较其与NC共转染相比相对荧光素酶活性显著降低（p＜0.01）， Notch1 3’UTR-MUT与miR-34a-5p mimics共转染较其与NC共转染相比相对荧光素酶活性差异无统计学意义；转染miR-34a-5p mimics后Notch1 mRNA和蛋白表达显著下调（p＜0.01）。5. 与Control组相比，MS组Notch1、NICD1、Hes1的蛋白水平显著降低，ANP、BNP的蛋白表达水平显著升高（p＜0.01）；与MS组相比，MS+STP组Notch1、NICD1、Hes1的蛋白水平显著升高，ANP、BNP 的蛋白表达水平显著降低（p＜0.01）；与MS+STP+NC组相比，MS+STP+miR-34a-5p mimics组Notch1、NICD1、Hes1的蛋白水平显著降低，ANP、BNP的蛋白表达水平显著升高（p＜0.05）。6. 与MS+STP+si-NC组相比，MS+STP+si-Notch1组ANP、BNP的蛋白表达水平显著升高（p＜0.01）。 结论：1. 蒙药四味土木香散对机械牵张诱导的大鼠H9c2心肌细胞肥大模型发挥保护作用。2. 在H9c2心肌细胞中，Notch1是microRNA-34a-5p的靶基因。3. 蒙药四味土木香散可能通过部分激活microRNA-34a-5p/Notch1通路缓解机械牵张诱导的H9c2心肌细胞肥大。
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