摘要
衣霉素是一类具有良好抗菌活性以及潜在抗肿瘤活性的核苷类抗生素，但由于其会抑制真核生物的 N-糖基化而对人体产生毒性，限制了其临床应用。有报道显示衣霉素类似物可显著降低毒副作用。研究衣霉素的生物合成通路允许我们通过后期酶改造来设计合成低毒安全有效的衣霉素的类似物，因此对衣霉素生物合成路径的研究有重要意义。本文主要验证了衣霉素核心结构衣霉胺的生物合成路径酶TunA、TunF和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）自由基酶TunB的活性和功能。并以SAM自由基酶BtrN为实验对象首次发现人工光敏蛋白PSP/NADH光照还原系统可以作为SAM自由基酶的有效还原剂，为这一重要酶家族的活性研究提供帮助。 本文首先进行了TunA、TunF蛋白的纯化，并通过其与起始底物UDP-GlcNAc孵育后的HPLC、NMR、LC-MS检测验证了活性，确认了TunA将UDP-GlcNAc脱去一分子水生成 UDP-6-deoxy-GlcNAc-5,6-ene，TunF 将该葡萄糖衍生物转化为半乳糖衍生物UDP-6-deoxy-GalNAc-5,6-ene（此为TunB底物）。本文用TunA、TunF分步催化的方法制备了UDP-6-deoxy-GalNAc-5,6-ene。 TunB属于SAM自由基酶，此类酶通过还原性的[4Fe-4S]簇与SAM 发生反应。小量表达时发现TunB为极不溶的蛋白。尝试TunB的12种同源蛋白也无法纯化。多种尝试后，我们在TunB的N端引入助溶标签MBP 后得以成功纯化。我们共构建了 5 个带 MBP tag 的载体，选取其中表达量较多的几个进行 TEV protease切除MBP tag的实验。但酶切后的TunB不稳定，与填料孵育后容易析出。最后，本文选择了表达量较大的 pMalc2X-MBP-His6-Factor Xa site-TunB （pMal-MFT）蛋白，保留MBP tag进行[4Fe-4S]簇重构并优化条件，成功构建了活性蛋白，并验证了其可以切割SAM产生5’-脱氧腺苷产物。 本文以SAM自由基酶BtrN为对象，发现光敏蛋白PSP/NADH光照还原系统可以还原SAM自由基酶的[4Fe-4S]簇。首先对BtrN进行了纯化并通过UV-vis光谱和Fe、S含量测定对[4Fe-4S]簇进行了表征。我们通过HPLC的活性分析选择了PSP最合适的牺牲还原剂NADH，并验证了牺牲还原剂的还原效果为NADH＞NaSH＞Phenol＞L-ascorbic acid。我们经HPLC分析确认了光还原体系的活性且验证了产物。我们最后通过颜色变化、UV-vis 光谱、EPR 光谱表征了对[4Fe-4S]的还原效果。由此，我们成功实现了SAM自由基酶铁硫簇的光照可控还原。
NETL