摘要
癌症是一种恶性疾病，严重威胁着人类的健康。最近的研究表明染色体外环状DNA (Extrachromosomal circular DNA，eccDNA)在癌症发生过程中发挥了至关重要的作用，虽然eccDNA的基因组研究近几年取得了不少突破，但对eccDNA的表观遗传学的研究还很缺乏。传统的二代测序方法，如ATAC-seq (The assay for transposase-accessible chromatin with sequencing)和 ChIP-seq (The chromatin immunoprecipitation assays with sequencing)等方法在进行eccDNA的表观遗传研究时，需要将DNA打断，进行短片段测序，不能提供完整的eccDNA染色质状态和无法获得不同状态下eccDNA分子的表观异质性。 所以本研究开发了一种eccDNA中酶标记染色质开放性的方法(Sequencing enzyme-accessible chromatin in eccDNA，CCDA-seq)，本方法对DNA使用甲基转移酶(M.ecoGⅡ)标记DNA中开放的染色质，而不对DNA进行片段化，并且对eccDNA进行富集，再经过牛津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technologies，ONT)测序，可以同时捕获一个长片段eccDNA分子上的碱基信息和染色质可及性信息。并通过生物信息学分析，研究了eccDNA与线性DNA的染色质可及性，主要结果如下: (1)CCDA-seq通过与二代测序DNase-seq(Deoxyribonuclease I hypersensitive site sequencing)进行比较，在高表达基因的转录起始位点(Transcription start site，TSS)和不同基因组尺度的染色质可及性分布显示两者染色质可及性分布相似，并通过PCR验证了eccDNA Junction位点的准确性，从而验证了该技术的可行性; (2) CCDA-seq在基因组全局上计算了eccDNA与线性DNA的染色质可及性得分，显示eccDNA比线性DNA的染色质可及性更高;CCDA-seq还在DNA长片段不同的长度尺度上绘制了eccDNA的中的染色质可及性信息，观察到了eccDNA中染色质可及性的多样性，在数千碱基长度尺度上定位到了核小体的分布和量化了单分子分辨率下远端调控元件的染色质状态的相关性; (3) CCDA-seq通过与线性DNA进行比较，发现eccDNA与线性DNA的染色质状态存在明显的差异，说明eccDNA与线性DNA的调控机制可能不同。 综上所述，CCDA-seq可用于研究单分子eccDNA的异质性和长距离的eccDNA的染色质状态，CCDA-seq丰富了对eccDNA染色质可及性的研究，增加了人们对eccDNA染色质可及性的认识，帮助人们了解eccDNA的不同调控机制。
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