摘要
代谢性炎症是一种低度慢性炎症，常由代谢功能紊乱、组织内代谢产物异常蓄积引发，参与包括肥胖症、2型糖尿病、脂肪肝、家族性高脂血症、痛风在内多种疾病的病理生理过程。研究表明循环中升高的游离脂肪酸，可激活NLRP3及NF-κB等炎症通路并促细胞合成分泌炎症因子，可能是导致代谢炎症的重要因素。然而针对循环中炎症因子的强化抗炎治疗，在预防代谢病相关的心血管事件方面未取得预期效果，提示代谢炎症与心血管疾病之间存在着传统炎症因子以外的病理联系。 细胞外囊泡(EVs)是一类质膜包被的囊泡状亚细胞结构的总称。根据形成机制可将异质性较高的EVs分为三个亚群:凋亡小体、微囊泡和外泌体。其中外泌体被视为细胞间囊泡运输的主导角色因而受到广泛关注。外泌体与微囊泡在理化性质上部分重叠，且缺乏区分二者的特异蛋白标记物，因此胞外囊泡MISEV指南建议将提纯所得“外泌体”样本称为small EVs(直径＜200nm),以描述特定大小的EVs亚群。 胞外囊泡可通过内吞作用、受体-配体结合、生物膜融合等方式与靶细胞交互，从而介导细胞间信息交流。其内容物随亲代细胞生理状态而发生动态变化，在慢性炎症、缺氧微环境、应激反应中发挥着重要调节作用。已有研究证据显示，应激状态下的单核细胞可通过释放EVs参与炎症反应。基于以上分析，我们猜测特定的病理状态，如代谢综合征患者常并发的胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱、血脂异常等，可能通过诱导单核细胞分泌EVs影响血管内皮细胞功能。 目的: 建立THP-1单核细胞的脂毒性损伤模型，并从细胞培养上清中提取EVs。将THP-1细胞源EVs与血管内皮细胞共孵育，检测内皮细胞在粘附、迁移、凋亡、增殖等多方面生理功能的变化，旨在揭示高脂环境下THP-1单核细胞与血管内皮细胞间信息传递的病理生理机制。 方法: 以200μmol/L棕榈酸酯(Palmitate，PA)处理THP-1单核细胞24小时建立脂毒性损伤模型，以THP-1细胞源EVs作为研究对象，提纯细胞培养上清中的EVs并与HUVEC共孵育，检测HUVEC在分子-细胞水平上的功能改变。包括:①Western Blot和RT-qPCR检测内皮功能相关分子在蛋白、mRNA水平的表达改变;②Transwell法及平板划痕法评估内皮细胞迁移能力③荧光染色法评估单核细胞-内皮细胞间粘附功能。 结果: 1、本实验通过经典的差异超速离心法成功从THP-1单核细胞培养上清中提取出EVs样本。电镜下可见，所得EVs呈典型的圆形、杯托形的囊泡状结构。NTA分析示EVs样品浓度峰值时粒径约在120-140nm，各组间粒径分布相当，符合MISEV建议的small EVs的定义。Western Blot验证EVs样本富集TSG101、HSP70蛋白等外泌体标志蛋白，而Calnexin、GAPDH等蛋白对应条带未见明显显影。这说明EVs样本没有或很少被杂蛋白污染，符合进一步做功能实验的标准。 2、获取THP-1细胞源EVs（棕榈酸处理组命名为PA-EVs，另设对照组），将HUVEC与所得EVs共孵育24小时。Western Blot证实，PA-EVs处理后内皮细胞的ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量明显升高(P＜0.01)。E-selectin表达水平有升高趋势，但无统计学意义(P=0.1681);余eNOS、BAX、TP53、Cyclin D等蛋白未见明显改变。RT-qPCR检测也发现了上述粘附相关蛋白的mRNA水平的升高。 3、进一步行平板划痕实验，分析划痕最终/初始面积可得，PA-EVs处理组划痕最终面积较对照组减少，提示内皮细胞迁移能力的增强。这一现象在Transwell实验中得到证实，PA-EVs处理组迁移到下室的平均内皮细胞数高于其他组(P＜0.05)。 4、荧光细胞粘附实验中，我们将HUVEC与EVs共孵育24小时后，弃去上清，向每组加入等体积、等密度的THP-1细胞悬液，1小时后洗去未附着细胞，显微镜下可见PA-EVs处理组中附着于培养皿底部HUVEC的单核细胞数增加，这与分子层面上，HUVEC合成表达粘附相关蛋白的增加相吻合。 结论: 棕榈酸诱导的THP-1单核细胞源EVs，可促血管内皮细胞合成VCAM-1、ICAM-1等粘附相关蛋白，有利于内皮细胞炎症反应。因此单核细胞源EVs可能是代谢疾病与血管内皮损伤的媒介之一。
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