摘要
目的: 在全球范围内，肺癌的死亡率位列恶性肿瘤第一位，虽然近些年来治疗方法较之前取得了很大的进展，除经典的手术切除、化疗、放疗、靶向治疗等，免疫治疗也成为肺癌治疗中的主流。而且对于晚期肺癌采用免疫治疗有效的患者，其总生存期对比传统化疗来讲，有明显的延长，但在整体非小细胞肺癌患者中，免疫治疗的总体有效率只有20％左右，免疫治疗仍面对着巨大的挑战，如何提高免疫治疗的疗效是目前研究的热点和难点之一。 BPIFB2是编码脂质转移/脂多糖结合蛋白的基因家族的一员，于2002年刚刚被发现。由于BPIL蛋白具有与LT/LBP家族相似的序列，因此二者在体内可能具有相似的基本功能，比如它们在炎症疾病组织中过度表达，表明可能这些基因在先天免疫功能中发挥作用。既往有一些研究探索了BPIL蛋白在细菌性肺炎、上消化道等的表达情况。但对于BPIFB2在肿瘤中的表达以及作用机制研究很少，目前只在胃癌、口腔癌的相关研究中被简单提及。BPIFB2在肺癌中的研究尚未见报道。 本文通过数据挖掘与实验相结合的方式，研究BPIFB2在肺腺癌中的表达及对肺腺癌趋化T细胞的影响。首先进行生物信息分析，利用TCGA公共数据库，结合反卷积算法探究肺腺癌患者肿瘤组织中免疫细胞浸润差异，同时针对不同的免疫状态进行基因集富集分析，探究肺腺癌的不同免疫浸润状态及潜在调控机制，选择冷肿瘤中高表达的基因BPIFB2作为后续研究对象;然后，检测临床病理标本中BPIFB2及免疫相关细胞因子、趋化因子在肺腺癌组织中的表达情况，分析其表达差异;接着进行体外实验，通过慢病毒转染系统构建敲低BPIFB2表达的肺腺癌细胞系，观察其增殖、凋亡情况，并检测对T细胞功能及趋化的影响;最后，探讨BPIFB2影响T细胞趋化作用的信号通路，并在体内实验中进行验证。希望通过本文的探索，能够进一步明确影响肺腺癌免疫治疗的相关作用机制，以期对后续肺腺癌的免疫治疗提供帮助。 方法: 1.通过生物信息分析技术分析肺腺癌免疫浸润状态并筛选出BPIFB2基因 首先，分别通过TCIA算法、Timer算法、X-cell算法分析肺腺癌患者组织中免疫细胞浸润程度，每种算法中分析CD8+T细胞浸润情况，取三种算法中均为CD8+T细胞高浸润定义为热肿瘤，CD8+T细胞低浸润的肿瘤组织为冷肿瘤。筛选冷热肿瘤中差异基因表达，同时针对不同的免疫状态进行基因集富集分析，选择冷肿瘤中高表达的BPIFB2作为后续研究对象。 2.BPIFB2及免疫相关细胞因子、趋化因子在肺腺癌患者中的表达 应用实时荧光定量技术检测BPIFB2 mRNA在肺腺癌中的表达情况，将其分为高表达组及低表达组，分析两组间患者临床参数的差异;采用实时荧光定量技术检测BPIFB2高低表达组中CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13、HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M、TAP1、TAP2等与T细胞免疫相关的细胞因子、趋化因子的mRNA表达情况，分析两组间差异;对TCGA数据库中肺腺癌患者BPIFB2与上述细胞因子、趋化因子的相关性进行分析。 3.BPIFB2对肺腺癌细胞生物学行为及对T细胞趋化作用的影响 通过Western blot及qPCR法选择在H322、A549、Calu-3中BPIFB2表达较高的细胞系，从而构建敲低BPIFB2的细胞系，采用Western blot及qPCR法验证敲低效率。通过流式细胞术的方法，检测BPIFB2敲低后肺腺癌细胞增殖及凋亡的变化情况;通过Transwell免疫趋化试验检测BPIFB2敲低后对肺腺癌趋化T细胞的数量及功能的影响。 4.BPIFB2影响T细胞趋化的机制研究 通过Western blot检测BPIFB2敲低后重要信号通路的变化，发现STAT3活化随着BPIFB2的敲低而下降;在正常H322细胞系中加入STAT3抑制剂，通过Western blot方法检测STAT3抑制情况，并通过qPCR法检测STAT3活性抑制后CCL4、CCL5、CXCL10三种趋化因子mRNA的表达情况，通过Transwell免疫趋化试验检测加入STAT3抑制剂后肺腺癌细胞对T细胞的趋化作用的影响;在正常H322细胞系中加入CCL5抑制剂，通过Transwell免疫趋化试验检测加入CCL5抑制剂后肺腺癌细胞对T细胞的趋化作用的影响。最后，构建BPIFB2敲低组与正常组的黑色素瘤小鼠模型，观察BPIFB2敲低对肿瘤生长的影响，并采用免疫组化方法检测肿瘤组织中BPIFB2、CCL5、CD8的表达情况。 结果: 1.生物信息技术分析结果 1) TCIA算法、Timer算法、X-cell算法计算肺腺癌样本中各免疫细胞浸润程度及相关性分析，定义CD8+T细胞高浸润的肿瘤组织为热肿瘤，CD8+T细胞低浸润的肿瘤组织为冷肿瘤。 2)基于冷热肿瘤筛选肺腺癌显著差异基因，筛选出冷肿瘤中高表达的BPIFB2基因作为后续研究对象。 3)“冷肿瘤”和“热肿瘤”之间分子特征及富集通路差异显著。 2.BPIFB2及免疫相关细胞因子、趋化因子在肺腺癌患者中的表达 1)将肺腺癌患者按照BPIFB2 mRNA表达的中位数分为两组，两组间BPIFB2 mRNA表达具有显著差异。 2) BPIFB2 mRNA高低表达组肺腺癌患者的临床参数无明显差异。 3)肺腺癌组织BPIFB2 mRNA高低表达组间CCL4、CCL5、CXCL 10 mRNA表达具有显著差异。 4)根据TCGA数据库进行分析，BPIFB2与CCL4、CCL5、CXCL10表达呈负相关。 3.BPIFB2对肺腺癌细胞生物学行为及对T细胞趋化作用的影响 1) H322在三组细胞系中BPIFB2表达最高，选择该细胞系构建BPIFB2敲低细胞株。 2) BPIFB2表达下降对肺腺癌细胞的凋亡及增殖无明显影响。 3) BPIFB2表达下降使肺腺癌细胞对CD8+T细胞的趋化数量增多，但对趋化的CD8+T细胞的功能无明显影响。 4.BPIFB2影响T细胞趋化的机制研究 1) STAT3活化随着BPIFB2表达下降而下降。 2)抑制STAT3活性后CCL5 mRNA表达升高。 3)抑制STAT3活性后肺腺癌趋化CD8+T细胞的数量增多。 4)抑制CCL5表达后肺腺癌趋化CD8+T细胞的数量减少。 5) BPIFB2敲低组黑色素瘤荷瘤小鼠较之对照组生存时间延长，肿瘤体积缩小，肿瘤重量减低。 6) BPIFB2敲低组黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤组织较之对照组BPIFB2表达下降，CCL5、CD8表达升高。 结论: 1)肺腺癌患者具有不同的免疫浸润状态，且“冷热肿瘤”之间分子特征及富集通路差异显著，BPIFB2在“冷肿瘤”中高表达。 2) BPIFB2表达高低对肺腺癌细胞的增殖及凋亡无明显影响，患者的临床参数亦无明显差异。 3)敲低BPIFB2通过抑制STAT3活化从而使肺腺癌表达CCL5增多，趋化CD8+T细胞数目增多，从而使冷肿瘤变热，增强免疫治疗疗效。
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