摘要
研究目的:费城染色体阴性的骨髓增殖性肿瘤(philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms，Ph-MPNs)是一组造血系统的异质性克隆性疾病，以一系或多系髓系成熟血细胞增殖为特征。原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)、真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）是Ph-MPNs的三大主要亚型。JAK2(Janus kinase 2，Janus激酶2)V617F是Ph-MPNs中发生频率最高的驱动突变。但是造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)中相同JAK2V617F突变引发上述不同MPN亚型的机制，特别是HSCs异质性与MPN特定亚型发病机制的关联，尚不完全清楚。此外，干扰素α(Interferon，IFNα)等药物对MPN患者HSCs的治疗效应和机制仍不明确。基于以上研究背景，本研究的主要目的是:(1)研究初诊JAK2V617F+ MPN不同亚型（ET和PV）患者HSCs的特征，探究其与MPN特定亚型发病机制的关联; (2)利用单细胞技术研究JAK2V617F初诊和治疗ET患者的HSCs异质性，解析HSCs异质性与ET发病机制、治疗反应的关联。 研究方法:(1)分选JAK2V617F+初诊ET和PV患者以及正常对照者(normal controls，NC)的HSCs，分别进行少量细胞转录组测序，解析ET和PV患者HSCs的特征，并通过流式细胞术进行验证。 (2)对常规单细胞转录组测序(Smart-seq2)技术进行改进，创新性建立了3''-Target-seq，即单细胞转录组测序联合单细胞基因型鉴定技术，以准确鉴定JAK2纯合突变(HOMO)、杂合突变(HET)和野生(WT)细胞，解析它们的转录组特征。 (3)分选JAK2V617F+初诊ET患者以及NC的单个HSC，分别进行3''-Target-seq，解析HOMO HSCs、HET HSCs和WT HSCs的转录组特征，并结合单细胞实时定量PCR、体外巨核分化实验、集落形成实验，探究ET发病机制。 (4)分选经IFNα单独治疗或IFNα联合羟基脲治疗的JAK2V617F+ ET患者的单个HSC，进行3''-Target-seq，并与初诊ET患者和NC的3''-Target-seq数据整合分析，解析IFNα等药物对ET JAK2纯合突变HSCs和杂合突变HSCs的治疗效应及机制。 研究结果:(1)初诊ET患者HSCs表现出增强的巨核谱系偏好性(Megakaryocyte lineage priming，Mk lineage priming)，而PV患者HSCs中未发现特定谱系偏好性。(2)初诊ET患者HSCs中IFN信号通路(IFNα response)上调。(3)短时间、低剂量IFNα联合IFNγ刺激对HSPCs或HSCs向巨核谱系分化具有促进作用。(4)JAK2突变促进ET HSCs巨核潜能增强和巨核偏好性HSCs (Mk-primed HSCs)比例增加。(5)初诊ET患者的JAK2突变HSCs对短时间、低剂量IFN刺激具有高敏性，更易向巨核谱系分化。(6)经过治疗的ET患者，其JAK2杂合突变HSCs表现出凋亡特征，而纯合突变HSCs表现出静息特征。 研究结论:本研究创新性建立了单细胞多组学技术，在单细胞水平实现了同时检测转录组和基因型，并通过单细胞技术发现了造血干细胞异质性与JAK2V617F+ET发病机制、治疗反应具有重要关联。初诊ET患者中，JAK2V617F+巨核偏好性HSCs的增加、IFN信号通路的上调和JAK2V617F+ HSCs对IFN信号刺激的高敏性促进巨核生成，这可能是导致ET发生的重要基础。治疗ET患者中，JAK2V617F+巨核偏好性HSCs比例降低，并且纯合突变HSCs和杂合突变HSCs表现出不同的转录组特征，纯合突变HSCs表现出静息特征，杂合突变HSCs表现出凋亡特征，这可能是IFNα等药物治疗ET的潜在机制之一。
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