摘要
免疫治疗是最具前景的肿瘤治疗方法之一。恶性肿瘤之所以能逃避免疫监视，是因为免疫细胞和恶性肿瘤自身会表达一些免疫共抑制分子及其相应受体，统称为免疫检查点分子，形成免疫抑制。T细胞免疫球蛋白粘蛋白3 (T cell immunoglobulin-3，Tim-3)是免疫检查点分子之一，主要表达于活化的CD4+和CD8+T细胞，其配体为Galectin-9。肿瘤细胞或肿瘤抗原递呈细胞表达Galectin-9，并与淋巴细胞的Tim-3结合，导致肿瘤微环境中T细胞消耗和效应下降。 有研究显示，人肾透明细胞癌和肾乳头状腺癌均高表达Tim3，且Tim3的高表达提示肿瘤浸润淋巴细胞功能失调。Tim-3不仅在免疫细胞上表达，也在一些肿瘤细胞上表达，以Tim-3为靶标的免疫治疗既能切断免疫抑制，提高抗肿瘤免疫作用，也能直接作用于肿瘤自身。因此，Tim-3抗体适合肾恶性肿瘤的治疗。 然而，免疫治疗抗体药物价格异常昂贵，限制了治疗药物的应用。生物药物的传统生产方式是造成免疫治疗药物价格昂贵的主要原因。因此，只有改变传统的表达生产方式，才能克服免疫治疗药物价格昂贵这个固有缺点。 乳酸菌、双歧杆菌等是肠道生物反应器最合适、最安全的宿主菌;非常适合作为重组蛋白（包括抗体）药物在肠道内表达和给药的载体。当然，大分子多肽肠道给药受到粘膜屏障的限制。然而，通过与霍乱毒素B亚基(CTB)融合表达可有效的让大分子多肽通过肠粘膜屏障进入血液循环。 研究目的： 以乳酸乳球菌为宿主菌在肠道内表达Tim-3单链抗体，检测其对小鼠免疫系统的促进作用，及对小鼠肾癌移植瘤的抑制作用。 研究方法： 通过癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)，分析肾透明细胞癌和肾乳头状腺癌组织中的Tim-3及Galectin 9的表达情况。采用分子克隆技术构建质粒pLAN-CTB-Tim3scFv和pLAN-Tim3scFv，采用电穿孔法转化乳酸乳球菌。体外实验:分析转化菌LZ-CTB-Tim3scFv和LZ-Tim3scFv的表达，ELISA法检测转化菌分泌蛋白的免疫活性，筛选转化菌表达融合蛋白最佳诱导条件，转化菌表达融合蛋白抑制小鼠肾腺癌细胞RAG细胞增殖的检测。体内试验:构建RAG小鼠肾腺癌皮下移植瘤模型，分析转化菌对小鼠肾腺癌皮下移植瘤体积变化的影响，转化菌对小鼠脾脏淋巴细胞活化的促进作用，转化菌抑制小鼠移植瘤的增殖，以及转化菌抑制小鼠移植瘤的血管生长。 研究结果： (1)人肾透明细胞癌和肾乳头状腺癌均高表达Tim-3及Galectin9。 (2)成功构建能分泌CTB-Tim3scFv和Tim3scFv单链抗体的转化乳酸乳球菌LZ-CTB-Tim3scFv和LZ-Tim3scFv。 (3) LZ-CTB-Tim3scFv转化菌的最佳诱导浓度为1.0ng/ml，最佳诱导时间为9h。 (4) LZ-CTB-Tim3scFv转化菌分泌的CTB-Tim3scFv具有免疫活性。 (5)与其他组对比，CTB-Tim3scFv更能抑制RAG细胞增殖。 (6) LZ-CTB-Tim3scFv转化菌喂饲小鼠后，转化菌分泌的CTB-Tim3scFv能促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖、活化。 (7) LZ-CTB-Tim3scFv转化菌喂饲小鼠后，转化菌分泌的CTB-Tim3scFv能抑制小鼠肿瘤体积增长，抑制肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤血管生成。 研究结论： 人肾透明细胞癌和肾乳头状腺癌均高表达Tim-3及Galectin 9。成功构建Tim-3单链抗体基因转化乳酸乳球菌。喂饲该转化菌能促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖、活化、抑制小鼠肿瘤体积增长、抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成。应用转化乳酸菌表达Tim3scFv，通过口服途径来进行晚期肾肿瘤免疫治疗，成本低、用药方便，有望成为肾癌免疫治疗新途径。
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