摘要
单链核酸可以因内部存在的互补序列而形成分子内二级结构（以下简称二级结构）。二级结构在体内外均有具有重要的生物学意义。tRNA（transfer-RNA）折叠成三叶草形结构，在翻译过程中转运氨基酸进入核糖体，并以mRNA为模板合成肽链;RNA的二级结构能辅助mRNA的正确剪接。DNA在体内如复制、转录和修复时是单链状态，也可形成二级结构。如DNA折叠形成的G四链体在端粒体延伸中发挥了重要作用;病毒单链DNA的二级结构也参与了蛋白识别。除了细胞内的生物学意义外，二级结构在生物技术应用中也发挥着重要的作用和影响。例如，自我折叠的分子信标被用来检测核酸、折叠成更复杂结构的适配体（aptamer）可用来识别和筛选蛋白。另一方面，二级结构还可能对核酸杂交、PCR以及Sanger测序产生干扰。 随着人口老龄化的加剧与居民医疗保健意识的提升，人们对精准医疗的诉求在不断加大。癌症已成为危害人类生命健康的头号敌人，没有对基因组、转录组、蛋白组的分析就不能了解疾病的发生发展、预防和治疗。核酸检测实现了对个人的基因组分析（SNP检测、稀有突变检测、甲基化水平检测等），提供个性化的诊断，在精准度、信息密度上远超其他诊断方式。其技术体系大致包括杂交、PCR、测序以及核酸质谱分析技术，而杂交、PCR和测序均和核酸杂交热力学密切相关。然而二级结构对杂交、PCR和Sanger测序均有不利影响，研究并正确认识和消除这些不利影响对于生物学研究和临床检测具有重要意义。 最邻近热力学模型(Nearest-neighbors thermodynamics (NNT))指出碱基对的稳定性取决于最临近的碱基，基于此理论和相关研究，已开发出预测折叠结构和杂交的程序和算法。结构预测和热力学参数的计算，对于开发出减弱结构不利影响的方法并指导实验设计具有重要意义。 首先，针对二级结构对杂交的抑制问题，我们开发了可以消除此抑制作用的新方法。使用外部和内部的寡核苷酸链（解链剂）来消除原有的二级结构，此方法高效经济、简单通用。并且基于核酸热力学的结构预测能够指导解链剂的序列设计，这大大增加实验实施的效率和成功率。 除此之外，我们还确认了二级结构对PCR（Taq酶）的抑制作用，且二级结构的稳定性越强抑制作用越大。进一步的，我们探索发现了此抑制的新机制，即Taq酶的内切酶活性导致了结构模板发生酶切，从而生成截短的PCR产物并导致PCR效率的降低。 接下来，为了解决结构抑制PCR的问题，除了通过提高退火/延伸温度、降低Mg2+浓度等优化的方法外，我们开发出了新的、通用且高效的基于解链剂的方法。解链剂是能够和模板的结构及附近区域互补配对的寡核苷酸链，通过链置换反应消除二级结构，恢复正常的PCR。rAAVITR序列对于病毒的复制、包装至关重要，因此分析其序列完整性对于基因治疗具有重要意义，但ITR中稳定性超强的T型结构会导致扩增和Sanger测序困难，而我们使用解链剂的方法很好地解决了扩增和测序问题。 最后，在Sanger测序中，我们还发现了由模板的二级结构导致的序列错误，即在测序序列的3''端出现了回文序列和突变，这一现象从未被报道过。我们的研究表明这也可能是Taq酶的内切酶活性导致的。 我们相信，围绕着二级结构对核酸杂交、PCR和Sanger测序的影响以及减弱这些影响的方法的研究探索，将有利于分子检测在生物研究和临床检测上有更好的应用。
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