摘要
玉米(Zea mays)的单向杂交不亲和(Unilateral cross-incompatibility, UCI)现象发现于1902年，为了研究其分子机制，本实验室构建了Ubi启动子驱动UCI基因ZmGa1S的表达载体，对玉米自交系综31 (Z31)进行遗传转化后，获得了13个独立的、不同雄性育性的T0代转基因株系(OE1-OE13)。本研究通过遗传学、分子生物学、细胞学和组学等方法，对Ubipro∷ZmGa1S转基因株系进行了系统的研究，以期创制和选育稳定的显性核雄性不育系(Dominant genic male-sterility,DGMS)，并探究DGMS系的分子机制。同时，适量表达ZmGa1S的转基因株系，其转基因配子的传递受阻，基于这一机制，我们开发了新的制种技术——花粉管抑制系统(Pollen tube inhibition，PTI)。主要结果如下: 1.以骨干自交系郑58 (Z58)为轮回亲本，对13个转基因株系进行了回交转育，获得了7个稳定的、Z58背景的DGMS转基因株系(OE1、OE2、OE4、OE6-8和OE13)。实时定量PCR (Quantitative real time PCR，qRT-PCR)分析表明，ZmGa1S对转基因植株雄性育性的影响具有剂量效应，ZmGa1S表达量越高，转基因植株的雄性不育程度越严重。 2.以完全雄性不育转基因株系OE13为代表，对其不育机制进行了系统研究。细胞学观察发现，OE13相比于Z58，绒毡层在花药发育时期6时提前降解，至时期9时几乎完全降解;致使小孢子减数分裂之后，缺少合成孢粉素等营养物质的场所和运输营养物质的乌式小体(Ubisch body, Ub)。OE13花药发育终止于时期11，其花粉外壁出现断裂且不连续的结构;同时OE13花药壁外表面光滑，未出现三维网格状角质层，以上的异常共同导致了败育。 3.转录组分析表明，在花药发育前期(时期5-6)，OE13和Z58的差异表达基因与绒毡层的提前降解密切相关。OE13绒毡层的提前降解可能受到一系列转录因子的调控。其它差异表达基因主要参与与绒毡层密切相关的玉米花药外壁角质层和花粉粒外壁的发育。 4.根据序列分析发现，ZmGa1S编码一个group 1果胶甲酯酶(Pectin methylesterase，PME)，仅含有PME结构域。在花药发育前期(时期6-7)，对花药总蛋白的PMEs活性进行了检测。结果发现，OE13的花药总蛋白PMEs活性显著低于Z58，暗示ZmGa1S可能会抑制其它PMEs的活性。酵母双杂交与荧光素酶互补实验进一步研究发现，ZmGa1S与花药发育前期高量表达的ZmPME41存在互作。我们推测ZmGa1S与ZmPME41互作，可能抑制了它的PME活性，从而影响了花药发育前期绒毡层细胞壁的果胶甲酯化平衡，诱发了绒毡层细胞的PCD，致使其提前降解。 5.通过遗传分析和花粉管延伸观察表明，ZmGa1S的适量表达能够抑制花粉管延伸，配子型地破坏授粉过程和转基因的遗传。以ZmGa1S为基础，利用ipe1(Irregular pollen exine1) GMS突变体和IPE1基因，开发了PTI系统。PTI表达载体包含育性恢复、花粉管抑制、荧光标记和除草剂筛选4个功能模块。我们分别使用Zm13、Pg47、IPE2和Ms6021启动子驱动ZmGa1S的适量时空表达，优化花粉管抑制模块。花粉管延伸观察和转基因种子的荧光标记证明，ZmGa1S只有通过Zm13或Pg47启动子驱动，才能够行使花粉管抑制模块的功能。 6.经过分子标记和微滴式数字PCR (droplet digital PCR，ddPCR)筛选的PTI保持系，在杂交过程中产生种子总数为二十万数量级的情况下，转基因传递率(Transgene transmission rate，TTR)依然为0.000％，低于已报道的同类制种技术。 综上，本研究基于ZmGa1S基因，通过基因工程手段，创制并选育了新型DGMS系，为玉米制种提供了新的资源。DGMS系的分子机制解析为其生产上的应用提供了理论基础。基于ZmGa1S基因开发的PTI系统，拥有极低的TTR，实现了玉米杂交种生产的高效性和低风险性。
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