摘要
在植物的表面和内部定殖着多样的微生物，这些与植物相关的微生物，其基因组可作为植物宿主的第二套基因组，来帮助植物抵抗胁迫（包括生物胁迫和非生物胁迫）和促进生长。由于植物内生菌能够在植物内部定殖，具有抢占生态位并繁殖扩增的能力，所以通过内生菌来协助植物抗病促生一直是该领域潜在的重要方向之一。但是多数内生菌难以分离培养，菌群的组成和定量以及各菌株在植物中的定殖特征均难以准确测定，因此通过内生菌进行抗病促生的研究进展缓慢。本论文探究通过内生细菌促进植物生长的方法，以水稻为研究对象，我们设计了三个不同的实验对这一科学问题进行探究。1）使用已知的定位和定量明确的内生菌表达促生相关的功能基因，建立促生菌的作用体系;2）分离培养水稻天然携带的内生菌并明确其占据生态位的过程;3）使用选定的水稻内生菌表达促生功能基因，探究促生性状的发生与内生菌定殖位置和定殖量的关系。 首先选用Xa21转基因水稻和水稻黄单胞菌菌株Xoo PXO99为实验模型，其中Xoo PXO99能够在Xa21转基因水稻叶内定殖，定殖量可测，定殖后Xa21转基因水稻能正常生长发育。由于定位于内生菌表面的蛋白能更有效地与植物的蛋白或小分子发生分子互作，因此我们将ACC脱氨酶基因acdS通过质粒携带，表达于细菌表面。所构建获得的促生工程菌命名为acdS-1和acdS-2。通过剪叶法接种两株工程菌后，PCR检测发现两株工程菌均定位于接种叶片，从接种位点向下延伸。接种工程菌显著增加了Xa21转基因水稻的株高和根长，并对植株的分蘖、叶鲜干重、根鲜干重的生物量有显著提高，还能诱导植株提前抽穗，且穗的生物量也得到显著增加。以上结果表明:以内生菌在限定生态位通过细菌表面表达ACC脱氨酶，能对水稻的生长发育产生显著的促生作用。 本实验室前期对水稻种传内生菌的研究发现泛菌属丰度最高，并分离培养了不同的泛菌菌株。基于菌群测序结果的OTU分析，本研究选择了OTU丰度最高的Pantoea glume菌株，进一步研究该菌株的定殖特征。我们在水稻种子的无菌培养体系中将P.glume导入高压除菌的土壤中，发现该菌株首先在新生植株的叶表和根表附着，随时间推移逐渐定殖到水稻根系内部，直至维管束中。将菌株定殖后的水稻幼苗移栽到自然的含菌土壤中，两周后依然能在根内部检测到P.glume菌株，但其丰度显著降低。这些结果表明:该P.glume菌株能定殖到水稻根内组织成为内生菌，但其长久占据水稻根内生态位的能力较弱。 我们将acdS基因通过质粒携带，并表达于P.glume的细菌表面。所构建获得的促生工程菌株命名为acdS-3。在水稻种子的无菌体系中将acdS-3接种到高压除菌的土壤中，以野生型的P.glume在相同条件下接种至无菌体系作为对照。我们发现:acdS-3显著提高了水稻植株的株高、根长和鲜重。这些结果初步表明了根际内生菌通过表面表达ACC脱氨酶促进水稻植株生长的功能。具体的促生动力学需要进一步研究。 总体上，本论文以已知的局部定位的内生菌确立了通过细菌表面表达ACC脱氨酶对植物发挥促生功能的模式，分离培养了水稻的种传内生菌，并初步确定了种传内生菌在水稻根内部定殖，通过表面表达ACC脱氨酶促进水稻生长的功能。本研究将为通过内生微生物对植物进行促生的研究提供新方法及内生菌资源。
NETL