摘要
新型冠状病毒肺炎 (Corona Virus Disease 2019，COVID-19) ，由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起，它的迅速传播造成了全球健康危机，同时，变异株的出现给检测诊断及疫情防控带来了新挑战。 为降低新型冠状病毒检测结果假阴性风险，减轻因靶区选择和引物设计造成的结果不准确现象，保证检测的特异性、灵敏度，本文进行新型冠状病毒双靶标荧光定量PCR检测，建立双靶标PCR体系并进行优化实验，对最终实验方案进行评价，评价内容包括灵敏度和线性范围，最低检测下限，拟合曲线性能优劣等。针对新型冠状病毒变异株的出现，本文建立了一种基于PARMS （ penta-primer amplification refractory mutation system ）技术的竞争性等位基因特异性PCR方法检测新型冠状病毒“关切变异株”(variant of concern，VOC) 关键突变位点并实现快速分型。针对新型冠状病毒VOC中关键基因突变位点N501Y、E484K、L452R，K417N、K417T、P681H分别设计竞争性等位基因特异性引物和通用引物，利用等位基因特异性聚合酶链式反应和荧光能量共振转移原理，对新型冠状病毒DNA片段进行鉴别区分。 结果显示所建立的双靶标荧光定量PCR检测方法中的N基因和ORF1ab基因扩增线性范围均可达到：1.3×106到13 copies/μL，N基因和ORF1ab基因R2值分别为0.999和0.997 ，扩增效率分别为104.17%和106.54%，经概率回归分析，双靶标荧光qPCR检测体系的最低检测下限是5.793 copies/μL (95%置信区间：2.261-7.325 copies/μL) ，所建立的检测方法灵敏度高，特异性强，检测性能良好。452、484、501位点的的最低检测下限分别是6.792 copies/μL (95%置信区间：4.93-8.605 copies/μL) ， 8.099 copies/μL (95%置信区间：6.074-10.321 copies/μL) ， 7.434 copies/μL (95% 置 信 区 间 :5.569-9.520 copies/μL) 。 417 (AAG/AAT) 、417 (AAG/ACG) 、681 (CCC/CAC) 位点的的最低检测下限分别是 8.384 copies/μL (95%置信区间：6.747-10.674 copies/μL) ， 8.704 copies/μL (95%置信区间：6.966-11.117 copies/μL) ，8.055 copies/μL (95%置信区间：6.504-10.125 copies/μL)。 本研究所建立的双靶标荧光定量PCR方法和PARMS技术具有快捷、高效、低成本的特点，用于流行的新型冠状病毒VOCs检测鉴别，有助于新冠疫情的快速精准防控。
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