摘要
国外已经有针对致癌性、内分泌干扰性、基因毒性等的替代方法，但截至目前，仍缺乏有关肝毒性实验的替代方法。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）广泛存在于食品和环境中，是我国污染小麦最严重的一种真菌毒素。DON的摄入超过肝脏本身的代谢能力时，可造成肝脏的急、慢性损伤。本研究基于食品污染物DON，以HepaRG和HepG2细胞为体外肝毒性评价模型，筛选敏感的肝毒性评价指标，初步建立肝毒性评价的体外肝细胞替代方法。 第一部分 体外肝毒性评价模型的建立及基于DON的肝毒性评价替代指标的筛选 目的: 使用HepaRG和HepG2细胞进行体外肝毒性评价模型的构建并筛选敏感的肝毒性评价替代指标。 方法: 根据分化流程将HepaRG细胞系分化并测定过碘酸-雪夫氏（PAS）染色和ALB （白蛋白）分泌量判定分化结果；CCK-8实验确定DON处理浓度和时间；DON处理后测定细胞肝功能相关指标即谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷胱甘肽巯基S转移酶（GST）水平及氧化应激水平指标即超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）；DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧簇（ROS）产生水平；TMRE 荧光探针检测细胞线粒体膜电位（MMP）变化；蛋白免疫印迹实验测定代谢及凋亡相关蛋白的表达水平。最后，综合以上结果比较两种细胞系的最低可观察效应浓度。 结果: （1） 相较于未分化组，分化完成后的 HepaRG 细胞倒置显微镜下可见明显的肝细胞样细胞与胆管样细胞；PAS染色显示分化的HepaRG细胞糖原储存量明显增加；分化细胞上清液的ALB分泌量显著增加。 （2） DON处理分化后的HepaRG和HepG2细胞24 h的IC50值分别为3.376μM和5.268μM。DON处理后：HepaRG细胞ALT、CAT显著降低，AST、SOD显著增加；HepG2细胞AST、GSH显著增加，CAT显著降低；HepaRG、HepG2细胞ROS产生量显著升高，MMP水平显著降低；HepaRG细胞Caspase-3、CYP2E1的蛋白表达显著降低；HepG2细胞Caspase-3的表达显著降低。 （3） 比较 HepaRG 细胞与 HepG2 细胞所有检测终点的最低可观察效应浓度， HepaRG细胞所有指标的LOEC值均低于HepG2细胞。 结论: AST、CAT、ROS、MMP、Caspase-3在两种细胞系中均能反映 DON的肝毒性作用，因此初步将以上指标作为肝毒性敏感指标的候选。检测终点 LOEC 值更低的HepaRG细胞比HepG2细胞对DON 的肝毒性更为敏感，更适合作为体外肝毒性评价模型。 第二部分 DON体外肝毒性评价指标可信性及相关性的证明 目的: 选择C57BL/6小鼠作为动物模型对肝毒性进行体内验证，以评价筛选出指标能否反映体内的真实状况。使用肝毒性化合物和非肝毒性化合物，以更为敏感的HepaRG细胞为体外模型，检验筛选出的评价指标ROS的预测效能。 方法: 将36只C57BL/6小鼠随机分为对照组和DON低（0.15 mg/kg.bw）、中（1.00 mg/kg.bw）、高（2.00 mg/kg.bw）三个剂量组。DON每天经口灌胃给予，染毒28天。小鼠肝脏切片HE染色；血清肝功能相关指标（ALT、AST、ALB、GST）及肝匀浆氧化应激水平指标（SOD、GSH、MDA、CAT）检测；肝脏冰冻切片ROS检测；JC-1荧光探针检测小鼠组织MMP水平；蛋白免疫印迹实验检测肝组织中的凋亡及代谢蛋白的表达量。CCK-8 实验确定肝毒性化合物和非肝毒性化合物孵育浓度。HepaRG细胞在适宜浓度下处理24 h后，检测每种化合物活性氧信号强度并绘制ROC曲线，进行预测效能的计算。 结果: （1） 相较于对照组，DON实验组小鼠肝体比与肝脏绝对重量均显著性升高。中剂量组肝脏苏木素-伊红（HE）染色发现肝细胞肿胀，轻微气球样变现象；高剂量组有明显的脂肪变性及肝细胞索紊乱，并且肝窦扩张、间隙增大。DON 实验组小鼠ALP、GST活性显著降低；GSH、CAT、SOD活性显著升高，MDA含量显著下降；小鼠肝脏ROS产生水平显著增加，MMP有下降趋势但无显著性。小鼠肝脏CYP2E1蛋白表达显著降低；Caspase-3、Bax蛋白表达显著增加。 （2） 对比DON处理后小鼠及细胞模型各毒性终点的检测结果，显示仅线粒体损伤指标ROS在两类模型中变化趋势一致，均显著增加。 （3） 四种具有肝毒性的化合物均能使HepaRG细胞的ROS产生量显著增加，大部分 ROS 发生显著变化所对应的化合物浓度要低于其 IC50 值。经无肝毒性化合物处理后的HepaRG细胞ROS产生量均无显著性差异。 （4） ROS产生量的ROC曲线下面积为0.778，灵敏度为94.1%，特异度为63.6%，最大约登指数为0.57，ROS的预测能力良好。 结论: 经过动物实验的验证，确定活性氧簇（ROS）作为体外肝毒性评价的敏感指标。8 种化合物的测定结果显示，ROS 在 HepaRG 细胞模型中的预测效能良好，较高的灵敏度说明ROS适合于体外肝毒性的初筛。
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