摘要
牡丹（Paeonia section Moutan DC.）原产于中国，在我国有着悠久的栽培历史。作为我国的传统名花，牡丹具有重要的观赏价值、经济价值和生态价值。牡丹繁殖方式多样，经过长期的自然选择和人工培育，种质资源十分丰富，目前国内外共有1200多个品种，包括10大花型，9大色系。但由于牡丹自然花期短暂且集中，无法满足人们的观赏需求，花期严重限制牡丹的观赏价值提升并限制当地的经济发展。因此，研究其花期调控和花瓣衰老的生物分子基础对早晚花品种选育具有重要意义。本研究以‘凤丹’（Paeonia ostiiT. Hong amp; J. X. Zhang）牡丹为试材，基于‘凤丹’牡丹三代全长转录组的测序结果，筛选出2条FLC基因序列，采用同源克隆的方法从‘凤丹’牡丹中克隆了两个花期调控相关基因 PoFLC1 和PoFLC2，对其进行生物信息学分析和时空表达模式分析，并对PoFLC1的基因功能进行探究。主要研究结果如下： （1）克隆获得了‘凤丹’PoFLC1 基因，PoFLC1 基因编码完整的开放阅读框537 bp，编码178个氨基酸。PoFLC1编码的蛋白亲疏水性及二级结构预测结果表明：该蛋白为亲水蛋白，其二级结构中 α-螺旋所占比例较高。通过对 PoFLC1的氨基酸序列构建系统进化树分析，其亲缘关系与葡萄较近，与酸枣等蛋白进化关系较远，推测‘凤丹’牡丹PoFLC1基因可能与葡萄FLC基因具有相似功能。 （2）利用 qRT-PCR 技术对 PoFLC1 基因的花瓣发育进程的表达特征进行分析，PoFLC1 基因主要在‘凤丹’初开期和半开期的花瓣中表达，且在‘凤丹’各组织部位均有表达。PoFLC1 基因在早花‘凤丹’盛开期的花瓣中相对表达量最高，与其他时期相比具有极显著差异，在露色期和半开期相对表达量极低。PoFLC1基因在晚花‘连鹤’露色期的花瓣中相对表达量最高。 （3）利用 pCAMBIA2300 和 pCAMBIA2300-GFP成功构建了 pCAMBIA2300-PoFLC1和pCAMBIA2300-PoFLC1-GFP双元表达载体，通过激光扫描共聚焦显微镜观察到该基因在细胞的细胞核中表达；利用蘸花法，对哥伦比亚野生型拟南芥进行侵染后，用卡那霉素进行筛选后，获得 T1、T2 代株系，进行基因初步的功能验证。观察同时期种植的野生型拟南芥和转基因拟南芥的抽薹开花情况，发现转基因植株的抽薹开花时间明显晚于野生型拟南芥。 （4）克隆获得了‘凤丹’PoFLC2 基因，PoFLC2 基因编码完整的开放阅读框651 bp，编码216个氨基酸。PoFLC2基因编码一个亲水蛋白，通过NCBI网站对其保守结构域进行预测，发现PoFLC2蛋白具有保守的lacZ超家族结构域。 （5）利用 qRT-PCR 技术对 PoFLC2 基因的花瓣发育进程的表达特征进行分析，PoFLC2 基因主要在‘凤丹’半开期的花瓣中表达，与其他组织部位相比叶片中表达量最高；PoFLC2 基因在早花‘凤丹’半开期的花瓣中相对表达量最高；PoFLC2基因在晚花‘连鹤’露色期的花瓣中相对表达量最高。分析PoFLC2基因在不同品种牡丹中的表达特性，结果表明在晚花‘连鹤’品种中表达量最高，与PoFLC1基因不同的是，其在早花‘凤丹’中表达量高于‘凤丹’。 综上，本研究克隆了花期调控基因 PoFLC1和 PoFLC2，采用 qRT-PCR技术探究了基因的表达模式，对 PoFLC1 进行拟南芥转化，初步明确了‘凤丹’ PoFLC1 的基因功能。为进一步解析牡丹花期调控网络，选育优良早晚花品种奠定基础。
NETL