摘要
糖尿病已成为严重威胁人类身体健康的常见慢性非传染性、多病因的代谢性疾病，其中以胰岛素低敏感性为特征的Ⅱ型糖尿病（T2DM）患者占 95%。目前临床治疗糖尿病的药物，均会产生不同程度的副作用。因此，寻找天然的食源性活性成分作为改善T2DM补充剂已成为当前研究的热点。许多研究表明食源性活性多肽具有降血糖的功能，但从复杂的蛋白酶解物中靶向性筛选降糖肽并对其多靶点、多途径降糖机制的研究较少。故本文利用网络药理学结合生物信息学技术从鲵皮胶原酶解物中靶向性筛选出5种降糖肽，对其改善T2DM的作用机制进行预测，并从细胞水平和基因水平检验降糖肽改善T2DM的多靶点、多途径的降糖机制，为食源性降糖肽的筛选和应用提供新的思路。本论文主要研究内容及结果如下： 1.采用超声辅助酶解制备鲵皮胶原蛋白肽，考察超声功率、超声时间和液固比三个自变量对水解度的影响，影响主次为：超声时间＞超声功率＞液固比。优化后的参数为：超声功率210 W，超声时间21 min，液固比20 mL/mg。此时鲵皮胶原蛋白肽的水解度为 49.38%±0.74%，且 82.33%肽段分子量小于 1000 Da。超声辅助可以提高胶原蛋白肽的水解度，增加小分子多肽含量。 2.基于网络药理学和生物信息学技术，靶向性筛选降糖肽并对其降糖机制进行预测。结果显示，从鲵皮胶原酶解物中筛选出五种（ GAPGPA、GPAGAP、GPAGPA、GPPGPA、GPVGPA）活性肽段。应用生物信息学平台及相关软件确定每种肽段改善T2DM的不同核心靶点及参与细胞凋亡、细胞应答和信号传导等生物学过程；分析出肽段的核心靶点主要富集在 PI3K-Akt、AGE-RAGE、FoxO、胰岛素抵抗等信号通路上。分子对接结果表明，五种肽段与其核心靶点之间可以通过氢键、范德华力等作用力连接形成稳定的构象。以上结果表明肽段改善T2DM的作用机制可能是通过多靶点、多通路来完成的。 3.采用体外细胞实验评价降糖肽对 IR-HepG2 细胞胰岛素抵抗的改善作用。成功构建高糖高胰岛素诱导产生的 IR-HepG2 细胞模型，用五种降糖肽处理 IR-HepG2细胞后，检测细胞内糖代谢、脂代谢、氧化应激指标。结果显示，五种降糖肽均能提高 IR-HepG2 细胞的葡萄糖消耗量，增加 IR-HepG2 细胞内的糖原含量、己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）活性，降低 IR-HepG2 细胞内甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）的含量从而降低脂质沉积，增加 IR-HepG2 细胞超氧化物歧化酶（ SOD ）活性，降低 IR-HepG2 细胞丙二醛（ MDA ）和活性氧（ROS）含量。细胞实验结果表明五种降糖肽可通过改善 IR-HepG2 细胞的糖代谢、脂代谢和氧化应激水平等多种代谢途径达到改善T2DM的目的。 4.筛选对 IR-HepG2 细胞改善效果最好的降糖肽 GPVGPA，进一步探讨其在改善 T2DM 过程中核心靶点基因 mRNA 表达水平的变化。实验结果表明， GPVGPA 可通过调控糖代谢（ PI3K/Akt ）、脂代谢（ PPAR ）、氧化应激（MAPK）信号通路靶点基因mRNA表达水平改善T2DM，揭示了GPVGPA通过多靶点、多途径改善T2DM的作用机制。
NETL