摘要
葡聚糖内切酶能有效催化天然纤维素的长链分解，广泛应用于食品、发酵工程、动物饲料、燃料和化学工业中。尤其是在食品加工中，葡聚糖内切酶能够破坏细胞壁，消除抗营养因子，将不溶的膳食纤维分解成可溶性糖，更利于人体吸收，在发酵工业中具有广阔应用前景。除了食品加工方面，随着碳中和目标的提出，合理有效利用生物质能源，减少对化石能源的使用，充分利用纤维素，成为我国解决资源和能源瓶颈制约、保证可持续发展的重要能源战略。其中葡聚糖内切酶通过对纤维素的 β-1，4糖苷键进行切割，将长链“剪”为短链，释放包含自由还原端和非还原端的小纤维颗粒，是纤维素水解最重要的酶之一，因此对葡聚糖内切印迹酶的需求引起了空前的关注。然而目前天然葡聚糖内切酶使用成本高、野生或选育的菌株生产性能不足等问题严重影响了它的应用，开发出一种成本可控、便于制备、可循环使用的人工模拟酶迫在眉睫。 分子印迹技术是一种为不同大小的分子创造多功能结合位点的有效方法，其原理是通过印迹模板分子，将识别位点包裹在聚合物网络中，然后洗脱模板分子，留下印迹空腔，创造出具有特异性、类似天然酶的活性位点。通过对天然葡聚糖内切酶作用机理的研究，以纤维二糖为模板，分制备出两种分子印迹模拟酶：水凝胶型葡聚糖内切印迹酶和核壳型葡聚糖内切印迹酶，并对两种内切模拟酶进行催化研究，主要研究内容如下： （1）采用沉淀聚合法制备了水凝胶型葡聚糖内切印迹酶，并通过傅里叶红外光谱仪、扫描电镜和差示扫描量热仪表征。以3-氨基苯硼酸为功能单体，纤维二糖为模板分子，N，N-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，过硫酸铵作为引发剂，另外制备了不加入模板分子的聚合物作为空白对照。采用红外光谱仪对印迹模拟酶的结构性质和特征基团进行归属，证明纤维二糖被成功印迹；采用扫描电镜对其形貌进行观察，印迹酶的空间间隙更大；采用差示扫描量热仪对其热稳定性进行分析，结果表明印迹酶的热稳定性更好，证明成功制备了水凝胶型葡聚糖内切印迹酶。 （2）采用表面印迹法制备了核壳型葡聚糖内切印迹酶并进行表征。以二氧化硅作为基底材料，在其表面先进行氨基化，然后接枝4-甲酰基苯硼酸，固定模板分子纤维二糖，以正硅酸四乙酯作为功能单体，调节溶液pH引发聚合，制备出核壳型葡聚糖内切印迹酶，并通过 X 射线光电子能谱仪、傅里叶红外光谱仪和差示扫描量热仪对其形貌特征、结构基团和热稳定性进行表征。结果表明，核壳型印迹酶空间结构比空白对照孔隙大，更易吸附模板分子纤维二糖。从傅里叶红外图谱分析，纤维二糖与功能单体间的共价作用，使羟基的吸收峰强度产生变化，证明模板被成功印迹；X 射线光电子能谱结果表明氨基和 4-甲酰基苯硼酸已成功修饰在二氧化硅表面，接枝量分别占7.28%和0.93%。 （3）对水凝胶型葡聚糖内切印迹酶和核壳型葡聚糖内切印迹酶的催化性能进行研究。通过对还原糖测定方法的比较，选择3，5-二硝基水杨酸比色法测定印迹酶催化底物产生的还原糖含量，对印迹酶催化效果分析。所得的标准曲线为Y=17.85X-0.0252，相关系数为 0.99935。通过对水凝胶型印迹酶的吸附性能研究，结果表明该印迹酶对1 mg/mL纤维二糖的吸附量为0.42 mg/mg，空白对照的吸附量为0.24 mg/mg，印迹因子为1.75。核壳型印迹酶对1 mg/mL纤维二糖的吸附量为0.53 mg/mg，空白对照的吸附量为0.20 mg/mg，印迹因子为2.65。当印迹酶与底物比例在2：1时，产生还原糖的含量最高，达到0.1948 mg，计算得到水凝胶型和核壳型葡聚糖内切印迹酶的酶活表达量分别为0.264 U/mL和0.25 U/mL。 本研究以 3-氨基苯硼酸为功能单体，纤维二糖为模板分子，沉淀聚合法制备出水凝胶型葡聚糖内切模拟酶；以二氧化硅为基底材料，正硅酸四乙酯为功能单体，通过表面印迹法制备出核壳型葡聚糖内切印迹酶，并对两种葡聚糖印迹酶催化效果分析。结果表明印迹酶催化性能良好，显著高于空白对照。本研究开发了两种简单、廉价的葡聚糖内切印迹酶，为模拟酶的仿生构建提供新的思路。所研制的两种葡聚糖内切印迹酶在食品加工领域具有广阔的应用前景和重要的实用价值，对于生物质能源的合理利用、可持续发展和实现碳中和也有重要意义。
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