摘要
中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)是土传小麦花叶病害的重要病原之一，其基因组含2条单链正义RNA (RNA1-2)。近年本实验室在大量前期工作的基础上成功构建了CWMV全长cDNA侵染性克隆。病毒诱导的基因沉默(V1GS)载体已成为研究植物基因功能的重要工具之一，利用VIGS载体已解析了包括转录因子、光合作用等过程相关基因的功能。为了研发CWMVVIGS载体，本文利用分子生物学方法对CWMV侵染性克隆进行了改造，并尝试将其应用于植物内源基因的沉默，主要取得了以下结果: 1、在CWMV侵染性克隆突变体M5的基础上，我们重组构建ΔCWMV:00载体，即在CWMV外壳蛋白基因后引入一个多克隆位点(MCS)。侵染性分析显示ΔCWMV:00能够侵染本氏烟和小麦，并引起植株花叶、黄化等类似病毒侵染的症状。Northern blot结果表明ΔCWMV:00可在本氏烟和小麦叶片中积累，表现出良好的系统侵染活性。 2、将本氏烟和小麦八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的部分片段分别插入到多克隆位点处，构建了ΔCWMV:NbPDS300、ΔCWMV:TaPDS300载体。定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析表明，与对照相比，内源NbPDS和TaPDS基因表达量下降65-75％;而且病毒诱导沉默的本氏烟和小麦植株均产生显著的光漂白现象。在ΔCWMV:00中分别插入长500-1500bp的PDS基因片段，测序和定量分析表明较长的插入片段可影响载体的稳定性和病毒诱导的基因沉默(VIGS)效率。 3、构建了模拟本氏烟miR165/166和小麦miR3134a靶基因产物(target mimicry)的载体ΔCWMV:STTMmiR165/166和ΔCWMV:STTMmiR3134a。将二者分别接种本氏烟和小麦，定量分析显示，本氏烟miR165/166和小麦miR3134a的表达量降低，而二者的靶基因表达量则上调，表明CWMV VIGS载体可适用于内源miRNA的沉默。因此，CWMV VIGS载体的构建为单双子叶植物基因功能分析提供了有价值的工具。 4、半胱氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白酶家族，广泛参与植物的生理过程且与病毒侵染有关。为了进一步分析其功能，我们从本氏烟克隆了一个编码CysP的基因(NbCysP)并在大肠杆菌中进行了重组表达;重组表达的NbCysP融合蛋白经过亲和层析纯化，免疫兔子制备多克隆抗体，Western印迹分析显示该抗体能和重组NbCysP蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一，表明所获得的CysP抗体具有良好的特异性。进一步检测分析显示NbCysP在本氏烟植株中呈高水平表达且受低温抑制。酵母双杂分析发现NbCysP可与CWMV外壳蛋白互作，Pull-down等实验进一步验证了二者互作。这些结果表明NbCysP可能在CWMV侵染过程中发挥重要作用。
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