摘要
在长期的进化过程中，植物进化出了多层次的免疫防卫系统来应对病原菌的侵染。第一个层面是通过细胞壁对病原微生物进行物理性的阻隔;第二个层面是通过细胞膜表面的模式识别受体对病原微生物模式分子(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的识别来启动相应免疫应答，即通常被称为PTI(PAMP-triggered immunity)的免疫过程;第三个层面则是通过植物细胞内抗性(R)蛋白识别病原微生物分泌的效应因子来实现的，这个过程被称作ETI (Effector-triggered immunity)。植物受到病原菌侵染引发ETI免疫后，在病原菌侵染点会发生局部的、快速的细胞死亡现象，称为超敏感防卫反应(HR)，这大都是由植物的抗病蛋白介导的。 植物中最大的一类抗病蛋白为nucleotide binding leucine rich repeat (NLR)蛋白。根据其N端结构域的不同，可分为含有coiled-coil (CC)和Toll/Interleukin-1-receptor (TIR)结构域的两类。在玉米中，一个抗锈病位点Rp1位于第10条染色体上，其中的两个CC类NLR蛋白编码基因Rp1-D和Rp1-dp2发生分子内重组产生了一个新的基因Rp1-D21，可以在玉米和烟草中诱导产生自主HR。我们以突变体Rp1-D21作为研究材料，通过转录组测序筛选到了一个编码E3泛素连接酶联结蛋白的基因ZmBPM1，在Rp1-D21突变体中表达显著上调。ZmBPM1含有MATH和BTB/POZ两个重要的结构域，其拟南芥中的同源蛋白与E3泛素连接酶CLRs相互作用形成蛋白复合体，介导多种转录因子的降解，参与多种信号途径的调控。 通过烟草瞬时表达系统，将ZmBPM1与其同源蛋白ZmBPM2分别与Rp1-D21在本生烟草叶片中瞬时共表达，发现ZmBPM1可以抑制Rp1-D21介导的HR表型，而ZmBPM2则不能抑制。将ZmBPM1和ZmBPM2分别与能够引起HR的Rp1-D21的信号域CCD21共表达也得到相同的结果。我们检测了ZmBPM1和ZmBPM2与Rp1-D21、CCD21以及非激活形式的Rp1-dp2共表达时的蛋白量，发现与ZmBPM1共同表达时，这三个蛋白的积累量比与ZmBPM2或GUS对照共表达时低，由此推测ZmBPM1能够部分降解Rp1-D21、CCD21以及Rp1-dp2蛋白，进而调控Rp1-D21和CCD21介导的HR。由于Rp1-D21在烟草中表达量较低，因此首先通过Co-IP实验验证目的蛋白与Rp1-dp2和CCD21的相互作用，实验结果表明ZmBPM1能够与Rp1-dp2和CCD21相互作用，而ZmBPM2则不能。由于ZmBPM1在拟南芥中的同源蛋白能够通过泛素途径降解互作蛋白，从而调控下游信号通路，因此我们初步验证了ZmBPM1是否通过26S蛋白酶体途径对Rp1-D21、CCD21以及Rp1-dp2进行降解。通过蛋白酶抑制剂MG132处理样品，进而检测蛋白积累量发现，MG132处理后，与ZmBPM1共表达的Rp1-D21和CC D21的蛋白积累量与对照相比并没有明显增加，因此我们认为ZmBPM1部分降解Rp1-D21和CCD21并不是通过26S蛋白酶体途径。 进一步通过亚细胞定位研究发现，ZmBPM1在细胞质中形成点状结构，并且ZmBPM1可以增加Rp1-D21和CCD21在细胞质中的点状结构定位，这些点状结构与细胞自噬小体非常相似。通过与细胞自噬标志蛋白CFP:NbATG8f共定位发现，ZmBPM1与CFP:NbATG8f存在部分共定位，说明ZmBPM1部分定位于自噬体中。前人研究发现，Rp1-D21和CCD21在细胞质和细胞核中的定位对于其介导的HR表型具有重要意义，而ZmBPM1与Rp1-D21和CCD21共表达后，将其转移到点状结构中，改变Rp1-D21和CCD21的定位，从而抑制了Rp1-D21和CD21介导产生的HR表型。 由于ZmBPM1含有两个重要的结构域:MATH和BTB/POZ，我们检测了MATH结构域与BTB/POZ结构域对CCD21介导HR的调控作用，发现MATH结构域可以抑制CD21介导的HR，Co-IP实验结果证明MATH结构域与CCD21相互作用。进一步的研究发现，MATH结构域也能够增加CCD21在细胞质中的点状结构定位。 综合以上结果，我们推测ZmBPM1通过与Rp1-D21互作将其转移到细胞自噬体中，进而通过细胞自噬将Rp1-D21降解，从而对Rp1-D21介导的HR进行调控。
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