丙酮酸羧化酶是TCA循环回补途径的重要酶，催化丙酮酸向草酰乙酸的转化，对于以TCA循环中间代谢物为前体的化合物生产，如天冬氨酸家族及谷氨酸家族氨基酸等，具有着重要的作用。多数生物的丙酮酸羧化酶的活性受到天冬氨酸的抑制和乙酰辅酶A的激活。目前对于天冬氨酸的抑制机理尚无明确报道，普遍认为天冬氨酸是乙酰辅酶A的竞争性拮抗剂，通过影响激活剂与丙酮酸羧化酶的结合，进而影响酶的活性。 本研究试图通过酶的抑制动力学和分子对接的方法，阐明天冬氨酸抑制的分子基础。通过抑制动力学实验，我们发现，天冬氨酸造成对底物HCO3-的Km值增大，但Vmax值不变，这与竞争性抑制剂的作用效果相似;通过两轮的分子对接计算，我们发现，天冬氨酸结合位点与底物HCO3-的结合位点有相当程度的叠合。因此我们推定天冬氨酸是HCO3-的竞争性抑制剂。 通过结构、序列的比对以及虚拟饱和突变等计算方法，我们对丙酮酸羧化酶中与天冬氨酸抑制相关的关键残基进行了预测。一共预测出50个点突变。实验证实这些位点突变大多可以解除天冬氨酸对丙酮酸羧化酶的抑制作用;但与此同时，突变体的比酶活亦有较大幅度的降低。其中一个突变体可以完全解除天冬氨酸的抑制作用，在20mM天冬氨酸存在的情况下，突变体的酶活仍能保持90％以上。结合结构等信息分析，我们推测在T355位加入一个-NH2后，可以有效地增大空间位阻，影响天冬氨酸与活性位点的结合;同时可以间接地改变结合区的构象，使R353可以与底物HCO3-产生极性作用。 通过本论文的研究，我们首次证实了天冬氨酸是丙酮酸羧化酶的竞争性抑制剂，通过影响底物HCO3-的结合，进而影响酶活。同时，我们对丙酮酸羧化酶中与抑制相关的关键位点进行了研究，并得到了若干可以解除天冬氨酸抑制的丙酮酸羧化酶突变体。这对于丙酮酸羧化酶的进一步理性设计和应用，具有重要的指导意义。
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