摘要
基因组编辑技术在基因功能研究以及遗传疾病的治疗中具有重要意义，CRISPR/Cas9作为第三代基因组编辑技术，自发现以来就因其简便、高效、低成本等诸多优点，在多个物种中得到了广泛应用。然而，相对于基因编辑技术的快速发展，基因编辑频率检测技术的发展却相对滞后。现有的基因编辑检测技术有Surveyor法，Sanger测序法，PCR-RFLP，HRM，NGS等，虽然得到了广泛使用，但是存在许多不足。例如，经典的Surveyor法虽然不需要特殊的仪器设备，但检测准确度低、操作繁琐;Sanger测序法却又耗时、耗力、耗钱等。为了能够适应基因编辑方法的快速应用，亟需一种简单、快速、经济并且准确度高的基因编辑检测方法。我们实验室前期开发了一种高效的基因编辑检测技术getPCR，基于PCR体系中Taq酶的高特异性特征，利用一旦基因组编辑产生indel就会造成引物和模板的不完全配对，从而无法有效扩增的原理，在定量PCR中选择性的精准定量未发生编辑的DNA比例，从而实现基因组编辑效率的检测。该方法操作简单，准确度高，对仪器试剂要求低，普通的生物实验室均可以完成。然而野生型Taq酶对引物-模板错配具有一定的容忍度，在有些情况下可能会降低检测结果的准确性。 我们认为造成Taq酶非特异性的主要原因是在Taq酶-引物-模板复合物中存在冗余的相互作用力，在稳定复合物的同时却使得Taq酶对引物-模板链之间的错配不敏感。在Taq酶的分子进化过程中，我们采用了理性设计和随机突变相结合的策略，对Taq酶分子中与DNA有直接相互作用的氨基酸逐个进行突变，以减少多余的相互作用力，并在此基础上利用易错PCR引入更多随机突变，构建Taq酶突变体库。进而基于一个高效的可同时检测Taq活性和特异性的变体筛选系统，筛选出高特异性Taq酶变体。 在利用点突变法构建的40个Taq变体中，9个变体完全失去了聚合酶活性，其余变体的特异性相对于野生型都有不同程度的改善。我们在此基础上进一步引入随机突变，从1316个克隆中选出了39个具有更高特异性的Taq变体。在大肠杆菌中进行了表达和纯化，进一步系统的评估了这些变体的活性和特异性，尤其是识别单碱基错配的能力，最终获得了Taq 388变体。该变体对各种类型的引物3''末端单碱基错配，以及引物3''末端第二位的碱基错配具有高度的识别能力和敏感性，大大提高了getPCR技术对基因组编辑产生的indel的识别和区分能力，并展现了在SNP基因分型应用中的潜力。
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