摘要
玉米是我国种植面积最广的作物，玉米产量的提高对于我国粮食安全和经济发展具有重要意义，热带玉米种质具有丰富的遗传多样性，对热带玉米种质的引进和利用能够极大程度地扩宽我国玉米育种的种质资源基础。光周期敏感性是热带玉米种质利用的主要限制因素，课题组前期克隆了玉米光周期敏感性主效QTL qDPS9的候选基因ZmPRR73。ZmPRR73基因编码PRRs家族蛋白，是生物钟中央振荡器核心转录因子，在玉米光周期反应中发挥重要的调控作用。本试验在课题组前期试验的基础上进一步克隆了 ZmPRR73 基因的启动子序列并对其进行活性验证，同时利用 RT-PCR 技术鉴定到 ZmPRR73 基因的一种内含子滞留类型的可变剪接体，最后利用实时荧光定量PCR技术分析了ZmPRR73基因的两种剪接体在不同组织部位和不同发育时期的表达特点以及不同光周期处理条件下的昼夜节律表达规律。主要结论如下： （1）在光周期钝感性玉米自交系黄早 4 与光周期敏感性玉米自交系CML288中分别获得了ZmPRR73基因ATG上游5′侧翼2426 bp和2306 bp的启动子序列，序列比对发现在ATG上游575 bp序列内两种材料启动子序列完全一致，表明该区域高度保守，但 575 bp 上游存在多个单碱基和三个大片段差异，其中在黄早4中存在一处140 bp的插入。 （2）顺式作用元件预测发现 ZmPRR73 基因启动子区域含有多种顺式作用元件，包括 G-box、Sp1、AE-box 等光响应元件，此外 ERE 元件、GC-motif 仅存在于黄早4启动子中，而WUN-motif仅存在于CML288启动子中；转录因子结合位点预测鉴定到多个已报道参与开花调控的转录因子家族的成员，同时序列差异造成 CPP、WRKY、MIKC_MADS 等家族部分成员仅与黄早 4 启动子结合，而NAC、MYB_related家族部分成员仅与CML288启动子结合。 （3）通过 GUS 染色技术对 ZmPRR73 基因启动子活性进行分析，结果表明本试验所得 ZmPRR73 基因启动子具有启动子活性，但其活性弱于 CaMV35S 启动子；通过 PCR 技术对启动子 5′端进行启动子顺式作用元件有目的的缺失构建完成3个长度启动子缺失载体。 （4）RT-PCR 试验鉴定到一种内含子滞留型可变剪接体，并命名为ZmPRR73-IR，由于内含子滞留造成其编码序列提前终止，仅编码 164 个氨基酸，与ZmPRR73蛋白相比缺少了601个氨基酸，生物信息学分析其编码蛋白属于酸性、亲水性、不稳定蛋白，亚细胞定位预测为细胞核。 （5）组织特异性表达分析结果表明 ZmPRR73-IR 在叶片中表达量最高，同时在花丝、雄穗、果穗等籽粒形成相关部位高表达，并且在各组织部位ZmPRR73-IR剪接体的相对表达水平均高于ZmPRR73；不同发育时期表达分析表明ZmPRR73及ZmPRR73-IR在各取样时期均有表达，但在第 9 片展开叶即光周期敏感时期表达量最高，表明ZmPRR73及ZmPRR73-IR参与玉米光周期调控。 （6）昼夜节律表达分析表明ZmPRR73及ZmPRR73-IR均存在昼夜节律，并以 24 h 为一个周期进行震荡表达，短日照条件下于光照后 6 h 达到表达高峰，长日照条件下于光照后9 h达到表达高峰，表达高峰在短日照条件下较长日照条件提前 3 h，而在相同日照条件下，两种材料及两种剪接体之间的表达规律相似，同时表达丰度均为ZmPRR73-IR高于ZmPRR73。 本试验对 ZmPRR73 这一光周期敏感型候选基因启动子及可变剪接体的研究，为解析 ZmPRR73 基因的功能及玉米光周期调控网络的分子机制提供理论参考。
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