利用CRISPR/Cas9技术突变生长素输出载体OsPIN9提高水稻抗冷性的研究

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中文摘要：水稻是重要的粮食作物，同时又是对冷胁迫最敏感的粮食作物。冷胁迫限制水稻的地理分布，严重影响水稻的生长发育、产量及品质。生长素是发现最早、研究最深入的植物激素，几乎参与调控植物所有的生长发育过程。生长素输出载体PIN家族通过调控生长素的局部含量及分布等参与调控植物生长发育过程。低温胁迫会影响生长素的极性运输，而单子叶植物特异的OsPIN9基因在冷胁迫中的作用仍不明确。本文利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得的ospin9突变体进行抗冷性研究，探究OsPIN9在水稻的抗冷性中的作用。主要研究结果如下：实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）分析表明，OsPIN9主要在幼苗期的根部表达，其次是茎、叶鞘、根茎结合部，叶片中的表达量最低；在灌浆期，OsPIN9主要在谷壳中表达，而在枝梗和幼穗中的表达量较低。通过对幼苗期植株的表型统计分析发现：培养7 d突变体的苗高显著低于野生型植株 (Wild-type, WT)，而根长和不定根数与 WT 没有显著差异；而培养14 d突变体的苗高、根长和不定根数都显著低于WT，表明OsPIN9在水稻的株型发育中发挥重要调控作用。光合色素含量测定结果表明，ospin9 突变体中叶绿素总含量、叶绿素 a、叶绿素 b 以及类胡萝卜素的含量均显著降低，表明 OsPIN9 参与调控水稻光合色素代谢。萘乙酸（1-Naphthlcetic acid, NAA）以及生长素极性运输抑制剂1-萘氨甲酰苯甲酸（N-1-naphthylphthalamic acid, NPA）处理实验表明，ospin9突变体根对NAA的敏感性降低；而突变体地上部则对NPA的敏感性降低。qRT-PCR分析进一步表明根和叶片中生长素合成关键基因OsYUCs的表达受到影响，表明OsPIN9突变扰乱了水稻体内生长素的平衡。基因表达分析表明模拟干旱胁迫和盐胁迫下OsPIN9分别在处理3 h和6 h时表达量显著提高，而后迅速下降。而冷胁迫可以迅速抑制OsPIN9的表达，且随着处理时间的延长，OsPIN9表达量逐渐降低，表明OsPIN9很可能在水稻抗冷性中发挥重要作用。抗冷性分析表明，突变体的存活率显著高于WT植株。冷胁迫4 d后ospin9突变体叶片台酚蓝染色较浅，电导率和MDA含量都显著低于WT植株，这些结果都表明OsPIN9突变提高了水稻的抗冷性。 Ca2+信号转导及ICE1-CBF-CORs途径在植物抗冷性中起着重要作用。基因表达分析表明，冷胁迫后 Ca2+信号相关基因OsCOLD1、OsCNGC9等及OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C等基因的表达都没有显著提高，说明Ca2+信号系统及ICE1-CBF-CORs途径在OsPIN9介导的水稻抗冷性中贡献不大。冷胁迫下活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生和清除在植物抗冷性中发挥着重要作用。冷胁迫36 h后，ospin9突变体叶片中ROS含量高于WT植株，而冷胁迫72 h后，突变体叶片中ROS含量低于WT植株。进一步抗氧化酶活性测定表明，冷胁迫36 h后，突变体叶片过氧化氢酶（Catalase, CAT）和过氧化物酶（ Peroxidase, POD ）的活性都显著高于 WT 植株，而超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）的活性与WT没有显著差异。冷胁迫处理72 h后，突变体与WT的CAT、POD和SOD活性已没有显著差异，这些结果表明ROS的产生和清除在OsPIN9介导的水稻抗冷性中起着关键作用。

作者：

杨晓祎

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关键词：

水稻抗冷性状基因编辑 ospin9突变体分子机制

授予学位：

硕士

学科专业：

作物学

导师：

胥华伟

学位年度：

2022

学位授予单位：

河南科技大学

语种：

中文

中图分类号：