摘要
链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，在自然界分布广泛。它的生长发育过程非常复杂，在这个过程中产生多种次级代谢产物，包括抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤抑制剂、细胞外酵素、活性酶等，其广泛应用在工业、医药业、农业、生物防治等方面，对人类的生活和生产过程都具有重要的作用和意义。天蓝色链霉菌是链霉菌的模式菌株，全基因组测序已于2002年完成，发现965个具有调控功能的基因。这些调控基因中，包含67对典型的双组分信号转导系统;65个控制基因转录调控的sigma因子，还有25个不属于任何蛋白家族的DNA结合调控蛋白等。然而，这些调控蛋白往往是一些全局性调控因子，且大部分的功能都是未知的，因此研究它的调控机制具有十分重要的意义。 本研究主要对天蓝色链霉菌中调控蛋白SCO5351的功能进行了初步研究，探究该蛋白在天蓝色链霉菌的形态发育和次级代谢产物生物合成过程中的生物学意义。 本研究首先构建用于sco5351突变的质粒，通过大肠杆菌和链霉菌接合转移的方式在天蓝色链霉菌M145中得到缺失sco5351基因的突变菌株△sco5351。 分别将天蓝色链霉菌M145和突变株△sco5351观察表型发现，在YBP固体培养基上，△sco5351气生菌丝的形成稍微延迟，且放线紫红素产量显著降低，十一烷基灵菌红素产量微弱下降，钙依赖性抗生素的合成也受到影响。为了确定△sco5351的表型变化是由于sco5351的缺失所引起的，我们构建了回补菌株C-△sco5351，C-△sco5351的表型能够恢复，表明突变株△sco5351的表型变化是由sco5351的缺失引起的。分别使用分光光度和生物活性测定等方法对相关的次级代谢产物Act、Red、CDA进行了定量分析，定量化M145与△sco5351的差异，确定了SCO5351能够影响Act、Red、CDA等三种抗生素的产量。扫描电子显微镜观察确定△sco5351中延迟产孢。 为了寻找SCO5351调控的基因群，采用RNA-sequence技术分析野生型M145和突变株△sco5351的基因表达差异。结果显示与M145相比△sco5351中有104个基因的表达明显上调，231个基因的表达明显下调。有多个与生长发育相关的的基因表达下调，包括编码气生菌丝表面疏水性外鞘组份的8个chaplin基因、2个rodlin基因。包括放线紫红素Act、十一烷基灵菌红素Red、钙依赖性抗生素CDA等次级代谢产物的合成基因簇表达水平也下调。对相关基因的表达值进行了RT-PCR定量分析验证，RT-PCR的结果与RNA-sequence的结果一致，说明sco5351不仅影响天蓝色链霉菌的形态发育，还对次级代谢产物的合成发挥调控功能。 为了寻找SCO5351直接调控的靶基因，我们在大肠杆菌中异源表达纯化His-SCO5351，进行了凝胶迁移分析。结果显示SCO5351不能够特异性地结合分化发育相关的chp、rdl基因的启动子，也不能结合次级代谢产物合成中的特异性调控因子actORF4、redD/redZ、cdaR等基因的启动子区域，表明SCO5351不直接结合这些基因的启动子区域调控分化发育或次级代谢产物的合成。 为下一步在体内寻找SCO5351的靶基因做准备。本课题分别构建了在SCO5351 C端和N端加3*Flag标签的回补菌株，发现表型完全恢复。而SCO5351具有形成二聚体的位点，二聚体位点的存在让我们猜测SCO5351可能与自身或者和其他蛋白形成二聚体，进而结合相关基因启动子区域发挥调控功能。为了验证这个二聚体位点的作用，我们对SCO5351的二聚体位点进行点突变，发现点突变的SCO5351不能够回补△sco5351的表型，表明二聚体位点对于SCO5351是十分重要的。 综合上述结果，确定了SCO5351能够影响天蓝色链霉菌的气生菌丝和孢子形成过程，也影响次级代谢产物Act、Red、CDA等的生物合成过程，是一个重要的全局性调控因子。
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