摘要
高温α-淀粉酶是淀粉工业的重要用酶，在淀粉的液化过程中起到至关重要的作用。目前工业应用的高温α-淀粉酶热稳定性依赖Ca2+是淀粉深加工的瓶颈，获得热稳定性不依赖Ca2+的高温α-淀粉酶是解决该问题的最有效途径之一。来自深海热液口的超嗜热古菌ThermococcussiciuliHJ21所产的高温α-淀粉酶（TSA），热稳定性好且不依赖于Ca2+的特点，使其具有良好的工业应用前景。 本文以TSA为研究对象，探索了该酶热稳定性不依赖于Ca2+的分子机理，主要进行了突变酶的构建、纯化和性质测定，TSA蛋白晶体的制备和解析、TSA热稳定性及钙离子依赖性机理研究。主要研究结果如下： 突变酶的构建、纯化和性质测定。利用同源建模的方法预测了TSA的三级结构，通过分析比对序列，推测出维持TSA热稳定性不依赖于Ca2+的可能关键氨基酸位点。对突变酶进行了结构预测与分析，利用定点突变技术获得了突变酶MCC（A175C、G176C）和突变酶MD（N417D）。对MCC和MD进行了酶学性质的研究，MCC和MD的最适作用温度与TSA一致，均为95℃；其中MCC的热稳定性是TSA的69%，MD与TSA相比热稳定性没有改变，两个突变酶热稳定性都不依赖Ca2+。 TSA蛋白晶体的制备和解析。经过疏水性分析，构建和纯化了可溶性酶蛋白。采用坐滴法在无盐、无缓冲液、沉淀剂为1.0M咪唑、pH7.0、酶蛋白浓度为10mg/mL的条件下，获得了酶蛋白晶体。通过X-射线衍射和分子置换法获得了TSA的结构，TSA结构由三个结构域组成，一个（Ca，Zn）双金属分子紧邻催化位点，另外两个Ca2+分别结合在结构域A和结构域C。 TSA热稳定性及钙离子依赖性机理研究。比较分析了TSA与Pyrococcuswoeseiα-淀粉酶（PWA）和Bacilluslicheniformisα-淀粉酶（BLA）结构的异同，推测TSA热稳定性不依赖于Ca2+的分子机理为：酶活性中心具有相对牢固的结构，（Ca，Zn）双金属分子在催化位点起稳固作用；除（Ca，Zn）双金属分子外，另外两个Ca2+与TSA紧密结合，内源Ca2+的存在稳定了TSA的结构，因此无需外源Ca2+的添加；拥有更小结构域B和相对更少的柔性区域使得TSA的整体结构十分紧凑，更能抵御高温。采用在高温下用EDTA螯合处理TSA的生化实验验证了以上假说。 本研究通过阐明TSA热稳定性不依赖Ca2+的分子机制，为今后通过酶的理性设计对目前热稳定性依赖Ca2+的高温酸性α-淀粉酶进行分子改造，获得适合工业应用、热稳定性不依赖Ca2+的高温α-淀粉酶提供理论依据。
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