摘要
粉红螺旋聚孢霉Clonostachysrosea是一类分布广泛的丝状真菌，可以寄生多种植物病原真菌，在温室和田间试验中显示出良好的生防潜力。研究表明，MAPK在病原真菌中参与产孢和菌丝生长等发育过程，还能够影响其致病力，但MAPK途径在菌寄生菌中的作用方式尚不明确。本实验室前期研究获得了一个编码MAPK的基因Crmapk，并发现该基因参与了粉红螺旋聚孢霉67-1的菌寄生过程。本研究在实验室前期构建的粉红螺旋聚孢霉高效菌株67-1寄生核盘菌转录组和MAPK基因缺失突变株寄生转录组的基础上，筛选出4个在不同转录组中均差异表达的基因Unigene6161、Unigene10411、Unigene12609和Unigene19020，通过实时荧光定量PCR验证其表达量，利用生物信息学分析软件初步预测基因功能，进而通过基因敲除与回补及生物学测定研究其功能。取得的主要结果如下： 以延伸因子EF1作为内参基因对差异表达基因进行荧光定量检测。结果表明，在菌核诱导下，24h时67-1菌株中Unigene6161和Unigene19020的表达量提高了4.0倍；Unigene10411和Unigene12609在48h表达量最高，分别为对照的10.3倍和2.3倍。而在MAPK基因缺失突变株中，Unigene6161的表达水平持续上调，48h时表达量较对照组增加了136.8倍；Unigene10411在寄生前期和寄生后期表达量为对照的6.7倍；Unigene12609在菌核诱导下表达量持续上调，48h时表达量最高，为对照的22.3倍；Unigene19020表达趋势与在67-1菌株中一致，但上升表达趋势提前至寄生前期，且表达量仅为对照的1.3倍。总体来看，4个基因的表达水平与转录组测序结果基本一致。 利用生物信息学方法分析了4个差异表达基因的氨基酸序列。结果发现，Unigene6161全长4380bp，编码一个由1459个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具亲水性，具有一个转运蛋白酶功能结构域，与炭疽病菌ColletotrichumhigginsianumABC-2型转运蛋白酶基因同源性最高，因此将该基因命名为CrABC。Unigene10411全长769bp，编码一个由477个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具亲水性，含有一个FAD功能结构域，与小毛盘菌属Lachnellulacervina氧化还原酶基因亲缘关系最近，故将该基因命名为CrFad。Unigene12609全长3687bp，编码一个由1228个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具亲水性，具有三个钙离子转运ATP酶功能结构域，与淡紫拟青霉Purpureocilliumlilacinum钙离子转运P型ATP酶同源性最高，因此将该基因命名为CrATPase。Unigene19020全长768bp，编码一个由255个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白为疏水性蛋白，具有一个SDR功能结构域，与单孢囊菌属Monosporascussp.假定蛋白以及镰刀菌Fusariumalbosuccineum短链脱氢酶基因的亲缘关系最近，故将该基因命名为CrSdr。 利用同源重组原理构建了4个基因的敲除载体pKH-KO-CrSdr、pKH-KO-CrFad、pKH-KO-CrABC和pKH-KO-CrATPase。通过PEG介导的原生质体转化对4个基因进行敲除，成功获得2个CrFad敲除突变株和3个CrSdr敲除突变株。根据目的基因CrSdr和CrFadamp;nbsp;全长，分别构建了回补载体pKN-CrSdr-Com和pKN-CrFad-Com，对敲除菌株进行转化获得2个CrSdr基因回补菌株?CrSdr-Com和1个CrFad基因回补菌株?CrFad-Com。 生物学测定发现，氧化还原酶基因CrFad敲除后对菌株的生长和产孢均没有影响，短链脱氢酶基因CrSdr敲除后菌株生长速率不变，但产孢量比野生菌株提高了43.2%。ΔCrFad和ΔCrSdr对NaCl、KCl和山梨醇引起的高渗胁迫表现出更强的敏感性，生物量积累明显减少。分别敲除2个基因后对番茄灰霉病菌、大豆菌核病菌和黄瓜枯萎病菌的拮抗作用明显减弱（P?0.05），对核盘菌菌核的寄生能力由野生型菌株的4级降为2级。ΔCrSdr温室对大豆菌核病和番茄灰霉病的防效分别降低了50.5%和75.8%。ΔCrFad对2种真菌病害的防效分别降低了60.1%和41.5%。CrSdr和CrFad基因回补后生防作用恢复。研究表明短链脱氢酶基因CrSdr和氧化还原酶基因CrFad在粉红螺旋聚孢霉菌寄生和生防过程中发挥着重要作用。本研究探究了MAPK途径在粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌过程中的作用，为揭示粉红螺旋聚孢霉菌寄生的分子机制奠定基础，对提高生防菌株的防病效果具有重要意义。
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