摘要
果聚糖蔗糖酶是一类属于糖苷酶68家族的糖基转移酶，能够以蔗糖为底物发生催化反应。基于受体的不同，可以发生水解、聚合和转糖基反应，特别是利用该酶的转糖基性能催化制备功能性低聚糖，已成为糖工程领域的研究热点，在食品、制药、农业等领域有着广阔的市场前景。 本课题对来自于Bacillussubtilis的果聚糖蔗糖酶（LRS）基因与载体pET-28a（+）进行重组，并转入E.coliBL21（DE3）中高效表达，获得基因工程菌E.coliBL21（DE3）/pET-28a（+）-LRS。本文主要从以下方面对LRS进行探究：包括LRS的基因克隆表达、酶学性质以及LRS的转糖基性能及其催化产物生物活性评价等。 LRS酶学性质结果表明，最适温度为50℃，在50℃下孵育90min，酶活力仍为原始酶活的88%；最适pH为5.5，在pH为6.0时孵育24h，酶活力是原始酶活力的95%，说明该酶有较好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活力促进作用明显，Cu2+和SDS对酶活有抑制作用。在以蔗糖为底物时，Km和Vmax值分别为22.06mmol/L和6.4μmol/(L·s)，表明该酶对蔗糖有较好的亲和力。以蔗糖为底物催化制备分子量均一的β-（2,6）糖苷键的果聚糖时，蔗糖转化率可达63.56%。 LRS具有转糖基功能，利用转糖基性能合成功能性低聚糖意义重大。确定了以乳糖为糖基受体，通过HPLC、MS、NMR等表征产物结构。并对催化工艺进行优化，确定最佳合成条件为300mM蔗糖和300mM乳糖，35℃下，pH为6.0时，酶浓度为5U/mL，反应12h，乳果三糖的最终产量为182mM。 评价乳果三糖能否促进益生菌增殖、有无细胞毒性、抗炎活性等生理功能，发酵实验结果表明，乳果三糖可以显著促进双歧杆菌、乳杆菌增殖及产酸，且增殖与产酸能力均强于低聚半乳糖和乳果糖，并且通过气相色谱测定发酵液中短链脂肪酸含量，发现乳酸和乙酸含量较高，有利于肠道代谢。MTT实验结果表明，当乳果三糖浓度小于25mg/mL时,对细胞几乎没有毒性。脂多糖诱导细胞炎症模型发现，当乳果三糖的浓度为10mg/mL时，可显著下调促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达，具有较为明显的抗炎作用。 本研究通过果聚糖蔗糖酶的转糖基功能合成功能性低聚糖，为果聚糖蔗糖酶更好地应用于生产提供基础，同时为单一聚合度低聚糖的制备提供参考。
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