摘要
淫羊藿是我国的传统中药，已有2000多年的应用历史。作为滋补类中药，淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种功效，除此之外它还具有促进蛋白合成、抗衰老、提高免疫功能、抑制肿瘤等功效;淫羊藿的多种药理作用已受到国内外学者的高度关注。目前，人们已从淫羊藿(EP)植物属中提取出270多种化合物，研究发现淫羊藿苷(ICA)和淫羊藿多糖(EPS)均为重要的淫羊藿有效活性成分。雄性小鼠的青春期始于出生后34至38d，公鼠青春期持续约20d。本研究采用EP、EPS和ICA对5周龄雄性昆明小鼠进行连续20d灌胃处理，试验结束后致死小鼠，收集睾丸、附睾和血样。HE染色观察小鼠睾丸组织形态学变化;检测小鼠附睾精子密度、血清睾酮(T)和促卵泡素(FSH)水平，并进一步检测睾酮合成调节基因3β-HSD、17β-HSD和StARmRNA相对表达量;研究淫羊藿及其主要活性成分对睾丸组织抗氧化能力的影响和睾丸细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的变化，探讨EP、EPS和ICA对青春期公鼠生殖发育的作用和机理。雄性昆明小鼠8周龄左右达到性成熟，小鼠精子发生的周期约为35d，人类抽烟一般都在性成熟后，尼古丁也是电子烟的主要有害物质。本试验选择9周龄公鼠，用ICA和尼古丁进行处理，连续处理35d，根据青春期雄性昆明小鼠的试验结果，选择本试验对精子密度与抗氧化能力提高的最佳药物剂量(ICA3mg相当于75mg/kgBW)，进一步研究该剂量下ICA对性成熟小鼠精子生成、血清睾酮水平和睾丸组织抗氧化能力的影响。观察ICA对尼古丁诱导的性成熟小鼠生殖毒性的保护作用，检测小鼠附睾精子密度和血清睾酮水平，同时检测睾酮合成调节基因的相对表达量和睾丸组织的抗氧化酶活性，以及睾丸组织抗氧化酶相关基因表达的变化，以期了解ICA对尼古丁诱导的生殖毒性的保护作用及机理，为ICA的临床应用提供基础数据。本研究共有4个部分试验内容: 试验1、淫羊藿及其主要活性成分对青春期公鼠生殖器官发育、精子生成和睾酮分泌的影响 本试验旨在研究EP、EPS和ICA对青春期雄性昆明小鼠生殖器官发育、附睾精子密度和睾酮分泌的影响。90只4周龄健康雄性昆明小鼠经1周适应性饲养后，随机分为EP、EPS和ICA处理组，并设置灌服0.1mL生理盐水对照组。各试验组每天分别灌服不同剂量EP、EPS和ICA，连续灌服20d后用颈椎脱臼法致死小鼠，收集睾丸、附睾和血样;全血室温放置2h后，离心分离血清，使用放射免疫测定法（RIA）分析血清睾酮和FSH水平，采用Real-timePCRSYBRgreen法检测小鼠睾丸组织3β-HSD、17β-HSD和StARmRNA相对表达量。与对照组相比，10mgEP、6mgEPS，3mg和5mgICA均可提高小鼠睾丸指数及附睾指数;除14mgEP组外，其余处理组小鼠的附睾精子密度均显著高于对照组。14mg剂量组血清睾酮(T)浓度与对照组差异不显著，且低于2mg、6mg和10mg组小鼠血清T浓度，血清FSH浓度则显著低于对照组;6mgEPS组小鼠血清T和FSH浓度显著高于对照组;3mgICA组小鼠血清T浓度也显著高于对照组，并高于其他ICA组，ICA各剂量组小鼠血清FSH浓度均显著高于对照组。本试验结果表明，EP、EPS和ICA可促进青春期公鼠的生殖发育，提高小鼠生殖器官指数和附睾精子密度，促进青春期雄性小鼠体内睾酮和FSH分泌，并提高睾丸组织3β-HSD、17β-HSD和StARmRNA的表达。 试验2、淫羊藿及其主要活性成分对青春期公鼠睾丸组织抗氧化和细胞凋亡相关基因表达的影响 旨在研究EP、EPS和ICA对青春期雄性昆明小鼠睾丸组织抗氧化酶活性和细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达的影响，探讨EP、EPS和ICA影响睾丸组织抗氧化作用和睾丸细胞凋亡的机理。5周龄青春期期雄性昆明小鼠分别灌服不同剂量EP、EPS和ICA，并设置灌服生理盐水对照。连续灌服20d后颈椎脱臼法致死小鼠，采集睾丸、附睾和血样;收集睾丸并于-80℃冷冻保存。匀浆仪匀浆睾丸组织，使用SOD、GSH-Px和MDA试剂盒分析睾丸组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量;采用Real-timePCRSYBRgreen法检测小鼠睾丸组织SOD1、SOD2、SOD3和GPx1mRNA相对表达量。采用Real-timePCRSYBRgreen法检测小鼠睾丸组织3β-HSD、17β-HSD、StARmRNA、Bax和Bcl-2mRNA相对表达量，用WesternBlotting检测睾丸组织凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。结果发现，EP6mg、10mg，EPS6mg、8mg，ICA3mg组SOD和GSH-Px活性均高于对照组，RT-PCR检测结果表明，EP、EPS和ICA可提高小鼠睾丸组织SOD1、SOD2、SOD3扣GPx1mRNA相对表达量;同时EP、EPS和ICA均可提高睾丸组织Bcl-2mRNA相对表达量，降低BaxmRNA相对表达量;提高睾丸组织Bcl-2蛋白表达量，降低Bax蛋白表达量，提高Bcl-2/Bax比值。 试验3、淫羊藿苷可减轻尼古丁诱导的精子生成和睾酮分泌减少的生殖毒性 本试验旨在研究ICA对尼古丁诱导的性成熟期雄性昆明小鼠精子数量和睾酮分泌减少的缓解作用，探讨ICA减轻尼古丁引起精子生成和睾酮分泌减少的机理。试验采用9周龄雄性昆明小鼠40只，随机分为对照组、尼古丁组、ICA组和尼古丁+ICA组。连续灌服35d后，颈椎脱臼法致死小鼠，采集睾丸、附睾和血样，收集睾丸并于-80℃冷冻保存。采用Real-timePCRSYBRgreen法检测小鼠睾丸组织3β-HSD、17β-HSD和StARmRNA相对表达量。结果表明，ICA组小鼠的精子密度和血清睾酮含量显著高于对照组，尼古丁组小鼠的精子密度和血清睾酮含量显著低于对照组，尼古丁+ICA处理组小鼠精子密度和血清睾酮含量显著高于尼古丁组。ICA处理组3β-HSD、17β-HSD和StARmRNA表达量均显著高于对照组，尼古丁组小鼠睾丸组织3β-HSD和StARmRNA表达量显著低于对照组，但3β-HSD和StARmRNA达量降低的趋势在尼古丁+ICA组得以逆转，以上结果说明，ICA可有效减轻尼古丁诱导的精子生成和睾酮分泌减少的生殖毒性。 试验4、淫羊藿苷缓解尼古丁诱导的睾丸组织氧化应激 旨在研究ICA对尼古丁诱导的性成熟期雄性昆明小鼠睾丸组织氧化应激的缓解作用，探讨ICA缓解尼古丁引起睾丸组织氧化应激的机理。试验采用9周龄雄性昆明小鼠40只，随机分为对照组、尼古丁组、ICA组和尼古丁+ICA组。连续灌服35d后，颈椎脱臼法致死，采集睾丸、附睾和血样，收集睾丸并于-80℃冷冻保存。匀浆仪匀浆睾丸组织，采用SOD、GSH-Px和MDA试剂盒分析睾丸组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量;用Real-timePCRSYBRgreen法检测小鼠睾丸组织SOD1、SOD2、SOD3和GPx1mRNA的相对表达量。结果发现，ICA组小鼠睾丸组织SOD、GSH-Px活性显著高于对照组，MDA含量显著低于对照组;尼古丁组小鼠睾丸组织SOD、GSH-Px活性显著低于对照组，MDA含量显著高于对照组;尼古丁+ICA处理组小鼠睾丸组织的SOD活性显著高于对照组，GSH-Px活性和MDA含量与对照组相比无显著差异。RT-PCR检测结果表明，ICA组小鼠睾丸组织SOD1、SOD3和GPx1mRNA的相对表达量显著高于对照组，尼古丁组小鼠睾丸组织SOD1相对表达量显著低于对照组，尼古丁+ICA处理组小鼠睾丸组织SOD1相对表达量显著高于对照组。结果表明，ICA可缓解尼古丁造成的小鼠睾丸组织抗氧化酶活性下降和MDA生成增多，从而提高睾丸组织的抗氧化能力，缓解尼古丁造成的睾丸组织氧化应激。
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