摘要
麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分，是维生素D等甾体类药物的重要前体，市场需求大且供不应求。目前，麦角固醇主要从酵母、青霉菌中提取，存在含量低、生产成本高、生产能力不足等问题。许多研究者通过超表达麦角固醇合成路径中1~2个基因或者理化诱变等方法改造酿酒酵母，缺乏对整个合成通路的系统研究。酿酒酵母合成麦角固醇的代谢工程改造，有望大幅提高麦角固醇产量。本文围绕酿酒酵母中麦角固醇合成与转运路径，系统分析筛选促进麦角固醇合成的候选关键酶，通过启动子替换、脂滴改造等方法实施模块化代谢工程改造，并结合培养条件优化，促进酿酒酵母中麦角固醇的合成，为利用酿酒酵母生产麦角固醇提供菌种代谢工程改造策略。取得的主要研究结果如下： （1）酿酒酵母中麦角固醇合成与转运路径候选关键酶筛选及其编码基因克隆。在系统分析酿酒酵母中麦角固醇合成及转运路径候选关键酶的基础上，利用分子对接技术对麦角固醇合成关键步骤酶：HMG-CoA还原酶、角鲨烯合成酶、角鲨烯环氧酶、甾醇还原酶进行虚拟筛选。结果表明，在UniProt数据库随机选择的不同生物来源的各16~20种酶中，来源于酿酒酵母的HMG-CoA还原酶（HMG1）、角鲨烯合成酶（ERG9）、角鲨烯环氧酶（ERG1）、甾醇还原酶（ERG4）与相应底物有较强亲和力。对候选关键酶的理化性质、跨膜结构域、与底物结合力等特征进行分析发现：酿酒酵母来源的ERG9、ERG4、ERG1可直接用于代谢工程改造，HMG1需要通过截短ERAD靶向结构域来消除产物反馈调节作用并提高酶活。 （2）对麦角固醇转运存储模块和以ERG9为枢纽的麦角固醇合成路径上、下游模块进行代谢工程改造，促进酿酒酵母合成麦角固醇。首先，通过PHXT7替换ARE2启动子以及敲除FLD1基因，优化麦角固醇转运存储模块，使过量合成的麦角固醇能大量转运并存储于脂滴；进一步通过PTEF1替换ERG1和ERG4的启动子，优化麦角固醇合成路径下游模块，加强下游代谢通量，避免中间产物积累，麦角固醇含量提高69.9%，产量提高66.6%，酵母生物量无显著性差异；最后，通过将PTEF1-tHMG1-TADH1整合至YPRCdelta15位点，优化麦角固醇合成路径上游模块，突破限速步骤，加强上游代谢通量，丰富前体供应，促进了酵母生长并增加生物量69.6%，麦角固醇含量增加66.9%，最终产量增加183.9%。 （3）基于培养条件优化的酵母工程菌WYP9发酵性能评价。单因素实验结果表明，蔗糖、麦芽糖是合适的碳源，酵母提取物是合适的氮源，培养基初始pH影响酵母工程菌WYP9发酵性能。正交试验获得优化的培养条件：42.75g/L蔗糖，45.00g/L麦芽糖，10.00g/L酵母提取物，培养基初始pH=5.80。与改造前酿酒酵母相比，酵母工程菌WYP9生物量提高212.1%，麦角固醇含量提高83.8%，最终产量提高473.5%。 综上所述，本研究提出了利用酿酒酵母发酵生产麦角固醇的代谢工程策略，即通过PHXT7替换ARE2启动子、敲除FLD1基因、PTEF1替换ERG1和ERG4启动子、PTEF1-tHMG1-TADH1整合至YPRCdelta15位点，改造酿酒酵母合成与转运麦角固醇路径等，使麦角固醇产量大幅提升。
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