摘要
目的对蝎毒多肽进行优化设计，获得具有活性好、稳定性好、毒性低的抗菌抗癌双功能蝎毒优化肽，并对其抗菌抗癌机制进行研究。 方法首先，通过最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）实验，筛选出具有抗菌活性的蝎毒原始肽；通过氨基酸替代的方法对蝎毒原始肽进行优化设计；并通过体外毒性实验、稳定性实验，从中筛选出抗菌活性好、毒性低、稳定性好的优化多肽。 再次，通过杀菌动力学、荧光动力学、DNA阻滞实验来探究优化多肽的体外作用机制。并探究该优化多肽对细菌生物被膜的影响，以及是否会诱导耐药性。同时还通过建立小鼠皮肤感染模型，来研究该优化多肽的体内抗菌活性。 最后，通过MTS实验来检测该优化多肽对癌细胞增殖能力的影响。进一步通过细胞膜实验、ANNEXINV-FITC/PI凋亡的检测、活性氧的检测、细胞线粒体膜电位的检测来探究该优化多肽对癌细胞的作用机制。 结果筛选获得一个活性较弱的抗微生物多肽Pacavin，通过优化设计获得了一个抗菌活性好、毒性低、稳定性好的优化蝎毒肽Pacavin-5K。Pacavin-5K对Staphylococcusaureus、Pseudomonasaeruginosa的MIC为6.25-12.5μg/mL。在经过60摄氏度24小时加热后，Pacavin-5K对Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa的MIC没有发生变化。Pacavin-5K在和血清孵育半小时后，对Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa的MIC都没有发生变化，孵育2小时后，对Staphylococcusaureus的MIC没有发生变化，对Pseudomonasaeruginosa的MIC由原来的12.5μg/mL变成了25μg/mL。 杀菌动力学实验显示，Pacavin-5K可以快速杀灭Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa且具有浓度和时间依赖性；荧光动力学实验显示，Pacavin-5K以浓度和时间依赖性方式破坏Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa的细胞膜；DNA阻滞实验显示，Pacavin-5K可与DNA结合，且与DNA的结构无关；抗生物被膜实验中，Pacavin-5K可抑制Staphylococcusaureus生物被膜的形成，而对Pseudomonasaeruginosa生物被膜的形成却没有影响；同时，Pacavin-5K不易诱导Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa产生耐药性；在小鼠皮肤感染模型中，Pacavin-5K和抗生素组均能显著降低感染部位的菌载量，并且二者无显著差异。 在抗癌功能研究中，Pacavin-5K可有效抑制肺癌细胞A549的增殖。细胞膜完整性实验显示，Pacavin-5K可破坏肺癌细胞A549细胞膜完整性；ANNEXINV-FITC/PI凋亡实验显示，Pacavin-5K可导致肺癌细胞A549早期和晚期凋亡；细胞活性氧检测显示，Pacavin-5K可引起肺癌细胞A549活性氧的积累；细胞线粒体膜电位检测显示，Pacavin-5K可引起肺癌细胞A549线粒体膜电位下降。 结论通过本研究，获得了活性好、毒性低、稳定性好的优化多肽Pacavin-5K。Pacavin-5K可通过破坏细胞膜，与DNA结合达到抗Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa的作用。Pacavin-5K可以抑制Staphylococcusaureus生物被膜的形成，且不易诱导Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa产生耐药性。同时，Pacavin-5K在体内也具有良好的抗Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa活性。除此之外，Pacavin-5K对肺癌细胞A549的增殖有抑制作用，并且可诱导肺癌细胞发生凋亡。 综上，Pacavin-5K可用于治疗Staphylococcusaureus和Pseudomonasaeruginosa引起的皮肤感染，还具有治疗肺癌及其伴随细菌感染的潜力。
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