摘要
芽囊原虫（Blastocystisspp.）是一种肠道原生生物，属于芽囊原虫科(Blastocystidae)。能引起人体腹泻、腹痛、便秘等胃肠道疾病和荨麻疹、皮疹、疲劳等临床症状，这些由芽囊原虫引起的一类疾病统称为芽囊原虫病。芽囊原虫作为一种人兽共患病原，常见多种亚型混合感染，不同程度地影响人和动物健康。本研究对我国部分地区羊源芽囊原虫感染情况进行了调查和遗传特征分析，建立了一种简便、快速、灵敏的荧光定量PCR方法，用阳性ST8分离株进行体外传代和SD大鼠感染试验，用建立的荧光定量PCR方法对传代和感染大鼠的荷虫量进行了定量检测，以评价体外传代效率和SD大鼠感染后荷虫数的变化。上述工作为我国人兽芽囊原虫病防控和进一步研究芽囊原虫的生物学特性奠定了基础。 1.我国部分地区羊源芽囊原虫感染情况调查 为了解不同地区羊芽囊原虫的感染情况，对来自7个省、区的704份羊粪便样品，基于核糖体小亚基基因（SSUrDNA）位点进行分子流行病学调查，并对羊源人兽共患亚型ST3、ST4进行多位点序列分型。结果显示，芽囊原虫总感染率为13.35％(94/704)，不同地区、不同品种间感染率差异极显著。共发现5个亚型(ST3、ST4、ST5、ST10和ST14)，其中ST3、ST4和ST5为人兽共患基因亚型。MLST分析ST3为Allele38且有2个基因位点发生了碱基突变，ST4包括Allele42、Allele92和Allele94三种等位基因。本次调查表明羊芽囊原虫感染客观存在，病原存在人兽共患亚型且具遗传多样性，应给予足够重视。 2.芽囊原虫荧光定量PCR检测方法建立及初步应用 为建立一种芽囊原虫荧光定量PCR检测方法，本研究参照GenBank登录的相关基因序列，设计合成1对特异性引物，对反应条件和反应体系进行优化，建立了快速检测芽囊原虫的荧光定量PCR方法。结果显示，该方法能有效扩增38～3.8×108copies·μL-1芽囊原虫目的基因标准质粒，建立的标准曲线呈现良好的线性关系，检测灵敏度为38copies·μL-1;对毕氏肠微孢子虫、隐孢子虫、艾美尔球虫、圆线虫、十二指肠贾第虫、阿米巴原虫、大肠杆菌等病原均无反应，重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1％。结果表明，建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性，为大量样品的快速定量检测、芽囊原虫的生物学特性研究、药物防治效果评价提供了技术手段。 3.芽囊原虫体外传代及SD大鼠感染试验 为了解芽囊原虫形态特征和生物学特性，尝试从粪便样品中分离培养芽囊原虫并进行不同形态的观察。综合已报道的方法，最后确定培养条件为高糖DMEM培养基，其中含（工作浓度）10％马血清，100U·mL-1青霉素，100μg·mL-1硫酸链霉素，2.5μg·mL-1两性霉素B，0.1％硫代乙酸醇钠。培养基液面封上1mL的液体石蜡，于37℃恒温培养。在上述条件下体外传代，能持续稳定获得有活性的芽囊原虫，为SD大鼠感染试验提供了材料。使用荧光定量方法检测芽囊原虫的体外培养增殖规律，发现到第7d仍有大量芽囊原虫存在。对SD大鼠进行感染，检测其荷虫量变化规律，在28d内出现4～5个排虫高峰。在连续体外传代过程中，发现芽囊原虫的数量保持相对稳定且较高的状态。
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