摘要
卵菌(Oomycete)隶属于藻菌界(Stramenopiles)，包含大量植物和动物病原菌，给农业生产和生态环境带来巨大威胁。大豆疫霉(Phytophthorasojae,P.sojae)是卵菌中重要的植物病原菌，主要侵染大豆根茎部引起大豆根茎腐烂病，每年给世界造成约20亿美元的经济损失，严重威胁着大豆生产。大豆疫霉在侵染寄主的过程中，能够分泌大量的蛋白干扰植物的免疫反应，这些分泌蛋白又被称为效应子。疫霉菌的效应子可以分为两大类，一类效应子可以进入寄主细胞干扰植物的免疫反应，即胞内效应子，这类效应子已有大量的研究报道;除了胞内效应子外，还有大量在质外体发挥作用的效应子，然而疫霉菌质外体效应子的研究还相对薄弱，因此本文对大豆疫霉侵染寄主过程中分泌并作用于寄主质外体的效应子进行鉴定和系统的功能分析。主要内容如下: 大豆疫霉质外体蛋白的鉴定。大豆疫霉在侵染阶段会分泌一些质外体蛋白，帮助自身侵染，为了鉴定大豆疫霉侵染阶段的质外体蛋白。本章节利用抽真空低速离心的方法提取大豆疫霉侵染大豆不同时间点的分泌蛋白，以及通过硫酸铵沉淀技术提取大豆疫霉在人工合成培养基中的分泌蛋白，利用新一代(A)KTA快速液相色谱对分泌蛋白进行分离纯化。利用LC-MS/MS技术对分泌蛋白样品进行质谱检测并检索大豆疫霉蛋白数据库，鉴定到280多个含有信号肽的分泌蛋白。生物信息学对质外体蛋白的结构域进行分析表明:40％的分泌蛋白与植物细胞壁降解相关，其中包括糖基水解酶家族、果胶水解酶家族以及角质酶家族;10％的分泌蛋白参与了蛋白质的降解，包括丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等;以及少数的与代谢相关酶类等。根据大豆疫霉侵染大豆的RNA-seq数据对质外体蛋白进行聚类分析，将质外体蛋白分为三类，即:侵染早期上调表达、侵染中后期上调表达、侵染过程中组成型表达。以上结果表明，大豆疫霉侵染阶段的分泌蛋白种类丰富，功能多样，在大豆疫霉不同的侵染阶段可能发挥不同的功能。 N-糖基化对大豆疫霉质外体效应子PsXEG1的毒性功能研究。PsXEG1是大豆疫霉侵染前期重要的致病因子，其毒性功能依赖于其自身的糖基水解酶活性。本研究发现大豆疫霉侵染大豆时能够分泌两种不同形态的PsXEG1，并且PsXEG1蛋白会被降解;同时两种形态的PsXEG1降解速度不同。因此，为了进一步研究PsXEG1发生降解的机制以及大豆疫霉分泌两种形态的原因。本章节利用PNGaseF、EndoH以及O-glycosidase处理PsXEG1蛋白，结果表明PNGaseF、EndoH能够作用于较大分子量的PsXEG1,证明较大分子量的PsXEG1发生N-糖基化修饰。N-糖基化抑制剂衣霉素能够抑制N糖基化的PsXEG1在体内合成，进一步证明PsXEG1能够在体内发生N-糖基化修饰。为了确认PsXEG1的糖基化位点，本实验通过对大豆疫霉纯化的PsXEG1蛋白进行质谱分析，鉴定到两个天冬酰胺N174和N190为PsXEG1的N-糖基化位点。生物信息学分析表明这两个位点在其他疫霉菌的XEG1蛋白中相对保守，推测这两个位点参与PsXEG1毒性功能。利用CRISPR/Cas9技术定点突变大豆疫霉基因组中PsXEG1糖基化位点，通过PCR、DNA测序以及单孢分离筛选到两个独立的PsXEG1N174A&N190A大豆疫霉突变体菌株(T91、T192)，突变体菌株在大豆黄化苗上的致病力减弱，证明N-糖基化参与了PsXEG1的毒性功能。进一步研究表明N-糖基化不影响PsXEG1的分泌和酶活性，然而PsXEG1N174A&N190A突变体在质外体不稳定并发生降解，说明N-糖基化参与维持PsXEG1在质外体的稳定性。天冬氨酸蛋白酶抑制剂能够抑制PsXEG1的降解，表明大豆中的天冬氨酸蛋白酶参与PsXEG1的降解。本实验室前期研究证明GmGIP1是PsXEG1的抑制子，通过抑制PsXEG1的酶活性提高对大豆疫霉的抗性。Co-IP、Pull-down实验表明，N-糖基化影响PsXEG1与GmGIP1的结合能力，生物膜干涉实验进一步证明非糖基化PsXEG1对GmGIP1具有更强的结合能力。以上结果表明，大豆疫霉通过N-糖基化修饰分泌两种不同形态的PsXEG1蛋白，N-糖基化修饰保护PsXEG1免受大豆中的天冬氨酸蛋白酶降解，并降低PsXEG1对GmGIP1的结合能力，从而帮助病原菌侵柒。 大豆天冬氨酸蛋白酶GmAP5降解非糖基化PsXEG1参与寄主抗性的机制研究。为了确认植物中参与非糖基化PsXEG1降解的天冬氨酸蛋白酶，因此本章节对大豆中的天冬氨酸蛋白酶进行了系统分析。GmGIP1属于天冬氨酸蛋白酶家族中的一类，由于酶活性位点突变使其能够特异性结合PsXEG1，因此我们推测GmGIP1具有酶活性的同源蛋白参与PsXEG1的降解。生物信息学分析GmGIP1在大豆中的同源基因，发现有29个同源基因含有两个天冬氨酸蛋白酶保守的催化结构域，并将这29个基因作为候选基因。基于大豆疫霉侵染大豆的转录组数据和质外体蛋白质组数据对候选基因进行深度分析，鉴定到2个基因与PsXEG1具有相似的转录模式。为了进一步确认这两个基因中哪一个参与非糖基化PsXEG1的降解。本实验在烟草中共表达PsXEG1N174A&N190A和这两个同源基因，证明其中一个基因(命名为GmAP5)能够参与非糖基化PsXEG1的降解。大豆中过表达/沉默GmAP5，接种大豆疫霉的抗性分析表明GmAP5参与寄主对大豆疫霉的抗性。Co-IP实验表明GmAP5只能够与非糖基化的PsXEG1互作，证明N-糖基化影响PsXEG1与GmAP5的互作。为了进一步验证GmAP5对PsXEG1的特异性，本实验在沉默和过表达GmAP5的毛状根上接种WT、T91以及T3(PsXEG1△)突变体。结果表明，T91突变体在沉默GmAP5的毛状根中的致病力与WT接近，在过表达GmAP5的毛状根中的致病力与T3突变体相近，证明N-糖基化在大豆疫霉侵染阶段保护PsXEG1免受GmAP5降解，GmAP5特异性结合并降解非糖基化的PsXEG1。PsXEG1酶活性抑制实验表明，与GmGIP1不同，GmAP5不能够抑制PsXEG1酶活性，证明GmGIP1与GmAP5结合PsXEG1具有不同生物学功能。对GmGIP1和GmAP5以及其同源基因进行进化分析，表明GmGIP1和GmAP5虽属于天冬氨酸蛋白酶家族，但在植物和病原菌长期互作的过程中向着不同方向进化，从而进化出不同功能来应对病原菌的PsXEG1蛋白，即:GmGIP1抑制PsXEG1酶活性;GmAP5降解PsXEG1。以上结果证明，植物通过分泌GmAP5降解非糖基化的PsXEG1提高寄主抗性，而病原菌通过N-糖基化修饰保护PsXEG1免受GmAP5降解。 大豆分泌蛋白GmPNGaseA的鉴定和抗性分析。生物信息学分析表明大豆疫霉质外体蛋白中有将近75％的蛋白含有N-糖基化保守的NXS/T结构域，说明大部分的分泌蛋白能够发生N-糖基化修饰。对这类蛋白的转录组进行聚类分析，表明这类蛋白参与大豆疫霉多个生理功能，那么植物是如何应对病原菌的糖基化修饰？为了鉴定大豆中的去糖基化酶，本研究通过分子筛对大豆分泌蛋白进行组分分离，将分泌蛋白分为9个组分。以糖蛋白标准品RNaseB为底物分析不同组分的去糖基化酶活性，利用液相质谱对含有酶活性的组分进行分析。通过对质谱鉴定的含有信号肽的分泌蛋白进行功能域分析，发现其中一个具有N-糖酰胺酶的功能域，命名为GmPNGaseA。在大豆质外体蛋白质谱中共鉴定到6个GmPNGaseA的特异性肽段，表明GmPNGaseA为大豆的分泌蛋白。GmPNGaseA的信号肽能将重组蛋白SP-RFP（红色荧光蛋白）分泌到胞外，进一步证明GmPNGaseA是分泌蛋白。毕赤酵母表达纯化的GmPNGaseA能够作用于糖蛋白标准底物RnaseB，证明GmPNGaseA具有去糖基化功能。为了研究GmPNGaseA在疫霉侵染阶段的功能，本实验在烟草中过表达GmPNGaseA并接种寄生疫霉。实验结果表明GmPNGaseA能够增强植物对寄生疫霉的抗性，证明GmPNGaseA参与植物对疫霉菌的抗性。烟草中共表达GmPNGaseA和PsXEG1，证明GmPNGaseA能够作用于大豆疫霉关键效应子PsXEG1，暗示GmPNGaseA作用于N-糖基化的效应子提高寄主抗性。以上结果表明:大豆疫霉通过N-糖基化修饰病原菌的效应子，帮助自身侵染，而植物通过分泌GmPNGaseA作用于N-糖基化的PsXEG1提高寄主抗性。
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