二磷酸尿苷葡糖/糖焦磷酸化酶OsUGPase1和OsUSPase1在维持水稻磷稳态中的功能研究

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中文摘要：磷(Phosphorus，P)是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，是构成许多生物大分子的关键组分，如核酸、磷脂、磷酸腺苷(ATP)和含磷的酶类等，同时磷也广泛地参与植物体内的物质合成、能量转移、信号转导等重要的生理生化过程。植物对磷素的获取途径主要是通过根系吸收无机磷酸盐(正磷酸盐，Pi)，但由于Pi很容易被土壤中的微生物转化成有机态磷或被钙、镁、铝、铁等金属阳离子固定，因而磷在土壤中的移动性和有效性很低，常常成为农田及自然生态系统中植物生长的主要限制因子之一。为了应对土壤环境中的低磷胁迫，植物已经进化出了一系列形态变化和生理生化方面的适应机制来提高磷有效性以及增强从土壤中获取磷的能力，而这些机制均是由一系列复杂而精巧的分子网络调控的。糖类，尤其是蔗糖在植物响应缺磷胁迫的过程中扮演着重要的信号分子的作用。植物在感知到缺磷信号时，首先是地上部碳水化合物含量会增加，因而深入揭示作物磷和碳代谢途径的交互作用及其调控机制对提高作物磷的吸收利用效率和培育磷高效作物具有重要意义。植物中蔗糖的合成主要发生在细胞质中，其合成前体是二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-Glc)。有两种酶可以催化以Glc-1-P为底物合成UDP-Glc的可逆反应:UTP+Glc-1-P(←UGPase/USPase→)UDP-Glc+PPi，分别是二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate-glucosepyrophosphorylase，UGPase)和二磷酸尿苷糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate-sugarpyrophosphorylase，USPase)。他们与另外一种酶(UDPN-acetylglucosaminepyrophosphorylase，UAPase)共同组成了二磷酸尿苷糖代谢焦磷酸化酶家族。在水稻(Oryzasativa)基因组中，已有报道显示OsUGPase1和OsUGPase2影响水稻的生殖生长。然而，在水稻中，究竟一共有哪些UDP糖代谢焦磷酸化酶家族成员，及其生理功能和调控机制均不明确。本研究以水稻品种日本晴为实验材料，分析了水稻UDP糖代谢焦磷酸化酶家族基因对低磷胁迫的响应。在此基础上，对其中两个缺磷胁迫响应强烈的基因，OsUGPase1和OsUSPase1开展深入研究。基于敲除OsUGPase1对水稻生长发育的影响尤为强烈，而敲除OsUSPase1对水稻生长发育的影响较小，本文重点鉴定了OsUGPase1影响水稻生长发育和参与水稻磷稳态调控可能的分子机制。所获得的主要结果如下: 1.为了明确水稻基因组中编码二磷酸尿苷糖代谢焦磷酸化酶的基因家族成员，采用生物信息学分析了与OsUGPase1和在其他植物基因组中已经报道的UGPase同源性较高的基因，发现了一共存在7个成员。其中有4个成员为UGPase，1个USPase，2个UAPase，其系统进化都相对保守。对水稻7个二磷酸尿苷糖代谢焦磷酸化酶家族成员启动子基序进行分析发现OsUGPase1和OsUSPase1的启动子区域同时存在P1BS，W-box和PHO三种参与磷饥饿信号网络的顺式作用元件，因此推测水稻部分UDP糖代谢焦磷酸化酶基因可以响应磷饥饿胁迫信号。 2.为了进一步明确水稻UDP糖代谢焦磷酸化酶家族基因对不同供磷水平的响应情况，利用RT-qPCR技术分析了7个成员在主要营养元素缺乏下的表达特征，结果显示有3个成员在叶片中受缺磷强烈特异诱导表达，分别是OsUGPase1，OsUGPase2和OsUSPase1。在此基础上，选择其中的OsUGPase1和OsUSPase1开展深入研究发现OsUGPase1和OsUSPase1在叶片和叶鞘中都可以受缺磷强烈诱导表达，并且表达丰度随着缺磷时间延长逐渐提高，而当恢复供磷后其表达迅速受到抑制。利用其内源启动子片段融合GUS报告基因获得转基因水稻，通过GUS染液染色发现OsUGPase1和OsUSPase1在主根、侧根、叶片和叶鞘均有表达。此外，水稻原生质体和烟草表皮细胞亚细胞定位分析显示OsUGPase1为一细胞质定位的蛋白。 3.为了观察OsUGPase1和OsUSPase1基因对水稻生长和发育的影响，通过根癌农杆菌介导的水稻转基因技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了OsUGPase1的过量表达和突变体植株。发现在田间生长条件下OsUGPase1过量表达植株呈现出了植株矮小，生物量降低的表型，而OsUGPase1敲除后严重影响水稻的结实，几乎不育。因此再利用RNA干涉技术获得了抑制OsUGPase1表达的植株，其在田间也呈现出株高分蘖减少，结实率降低的表型。利用同样的技术获得了OsUSPase1的过量表达和抑制表达的转基因植株，发现其在田间的表型和日本晴野生型相比差异较小。 4.为了深入鉴定OsUGPase1和OsUSPase1在维持水稻碳代谢以及磷素积累中的功能，利用过量表达材料、杂舍突变体后代分离群体以及RNAi材料开展盆栽和水培试验。结果发现在正常供磷(200μMPi)条件下，过量表达OsUGPase1可以提高蔗糖在水稻地上部和根部的积累;抑制OsUGPase1的表达则可以降低正常供磷(200μMPi)和低磷(10μMPi)条件下水稻地上部和根部的蔗糖含量，同时促进淀粉的积累。值得注意的是，过量表达OsUSPase1同样提高了正常供磷水平下水稻地上部和根部的蔗糖含量，但是提高的比例和过量表达OsUGPase1相比则较低。 5.利用32P同位素标记发现，过量表达OsUGPase1显著提高了水稻根系在正常供磷条件下对磷酸盐的吸收能力，提高了水稻根部和地上部的总磷及无机磷含量;抑制OsUGPase1的表达则降低低磷条件下水稻根系对磷酸盐的吸收速率，提高叶片液泡内存储的无机磷含量，降低细胞质内的无机磷含量，显著提高地上部无机磷和总磷的含量。与此同时，发现过量表达OsUSPase1显著提高了正常供磷条件下水稻地上部和根部的无机磷和总磷含量，而抑制OsUSPase1的表达促进了正常供磷条件下无机磷在水稻叶片中的积累。但是抑制OsUSPase1的表达对水稻磷素积累的影响要明显低于OsUGPase1。 6.利用RT-qPCR技术分析发现敲除OsUGPase1的表达可以强烈改变水稻磷酸盐转运蛋白家族基因和其他一些参与响应低磷信号基因的表达。在正常供磷条件下的根系中，SPX1，SPX2和SQD2等基因的表达发生了上调，而OsPHT1;4和OsPHT1;8的表达发生了下调;在地上部，OsPHT1;2和SPX，SPX2，SQD2等基因的表达均受到了不同程度的增强。在缺磷条件下的根系中，除OsPHT1;2和OsPHT1;4的表达发生了下调以外，SPX1，SPX2，IPS1和OsPHT1;8的表达均发生了增强;在地上部，几乎所有检测的参与响应低磷信号基因的表达都有所提高。推测抑制OUGPase1的表达导致的PSI基因的上调是细胞质磷浓度下降的直接后果。 7.为了明确OsUGPase1是否具有催化合成二磷酸尿苷葡萄糖的能力，利用大肠杆菌异源表达系统进行了验证，发现OsUGPase1的确具有催化合成UDP-Glc的酶活性，和文献报道的相同。综上所述，我们在水稻中深入研究了两个二磷酸尿苷糖代谢焦磷酸化酶OsUGPase1和OsUSPase1的功能，发现其参与了水稻体内碳水化合物的合成、分配，并且OsUGPase1参与蔗糖代谢的功能要明显强于OsUSPase1。同时两种酶都参与了水稻磷素的吸收、分配。其研究结果为揭示作物碳和磷代谢途径交互作用提供分子证据，同时为培育磷高效作物提供了重要线索。

作者：

张雯琦

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关键词：

水稻磷饥饿胁迫蔗糖碳代谢 OsUGPase1 OsUSPase1

授予学位：

博士

学科专业：

农业资源与环境；植物营养学

导师：

徐国华；顾冕

学位年度：

2020

学位授予单位：

南京农业大学

语种：

中文

中图分类号：